提RNA反转录的详细流.docVIP

SMART 技术制备 GS FLX 样品cDNA详细流程 第一天 RNA的提取 用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)： 在1.5 ml管中加入600ulRLT和6ul B-巯基乙醇 取10—30mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎， 3—5min 12000rpm/3min,取上清移入新管 加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作) 加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液 加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min 将收集柱移入1.5mlRnase-free管中，加30—50ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次) 9）定量，跑胶 用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染 反应体系：共100ul 87.5ul RNA 溶液 10ul buffer RDD 2.5ul Dnase I储存液（配制：干粉溶于550ul的Rnase-Free ddH20中，分装，-20℃保存） 2）20—25℃孕育10min 用Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化 1）100ul除DNA后的RNA+350ulRLT,混匀 2）加入250ul无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液 3）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 4）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min 5) 换1.5ml管，加30—50ulRnase-free water，置1min,10000rpm/1min 6）定量，跑胶 第二天 反转录（SMART Kit,详见Manual） 1.做逆转录之前对RNA的处理： 浓缩RNA 1）在所提取的RNA里（大约为10ug），加无水乙醇（2倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1倍体积） 2）-70℃, 酝酿40min或过夜. 3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min 4）弃上清，用70%的乙醇洗两次。即加1ml 70%乙醇，把沉淀弹起，12000rpm/5min. 5）弃上清，37℃干燥。 6）加Rnase free water 30---40ul, 分装。-70℃保存！ 反转录合成1链cDNA 需要1ng---2ug总RNA或0.5ng—1ug polyA RNA 1—3.5ulRNA+1ul改进的3‘primer(12uM),( 3‘primer用时需稀释到12uM，离心)，总反应体积必为4.5ul，混匀 72℃,3min; 42℃,2min 加入以下反应液（4.5ul sample + 5.5ul反应液，总反应体积为10ul）： 2ul 5xFirst-Strand Buffer 0.25ul DTT(100mM) 1ul dNTP Mix (10mM) 1ul SMARTer II A Oligonucleotide (12uM) 0.25ul Rnase Inhibitor 1ul SMARTScribe Reverse Transcriptase (100u) 42℃,60min; 45℃,15min;72℃,10min.得到第一链cDNA 加入TE稀释（-20c保存3个月） 总RNA + 40ul TE 起始量0.2ug polyA RNA + 190ul TE 起始量0.2ug polyA RNA + 90ul TE 合成双链DNA 反应液：（总反应体积：90ul反应液+10ul稀释的1链cDNA） 74ul 去离子水 10ul 10XPCR buffer 2ul 50XdNTP Mix (10mM) 2ul 5‘PCR primer IIA (12uM) 2ul Polymerase (Extaq 酶) 反应体系: 95℃ 1min 95℃ 15s 65℃ 30s 15—20 cy