自由参考基的检测.doc

自由基检测方法自由基检测方法＊ 赵宝洪1，高　洪1* （1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.海关总署缉私局瑞丽缉毒犬基地，云南瑞丽 678600）? 关键词：自由基；检测方法；概述? 自由基(free radicals，FRs)化学反应性极强，极不稳定，半衰期短，其化学反应性的特点是连锁反应，一经启动即可连续发生。从生物学角度讲，通常所说的FRs主要是指活性氧(active oxygen)，即氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物。由于FRs具有活泼的化学反应特性，因而在生物体内具有重要的生理及病理功能，具有重要的生物学意义[14]。自1900年，Gomberg M首次证实三苯甲基自由基以来，自由基参与生命过程中许多重要的生化反应逐步为人们所认识，特别是随着现代检测分析技术的日新月异，自由基在生物和病理学领域的作用研究迅速发展。而寻求简便、快速、准确、高效的自由基检测方法成为研究自由基生物学作用的关键[5]。 与医学密切相关的自由基是氧自由基(oxygen free radical，OFR)，包括超氧阴离子和羟自由基，大量研究结果表明自由基与许多疾病的发生有着密切的联系，特别是与生物膜损伤的关系更是目前研究的热点[69]。自由基已日益受到人们的重视，现将自由基的检测方法介绍如下。 1 机体内清除自由基的酶系统主要有超氧化物歧化酶(Superoxide dimutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase ，CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH Px)等酶类组成。在正常情况下，机体代谢过程中产生的超氧阴离子自由基被细胞的SOD歧化为H2O2，后者再由细胞浆的CAT 和GSHPx催化降解为水和氧。 1.1 SOD属于金属酶， 分CuZnSOD、MnSOD、FeSOD 3种。由于SOD的底物超氧阴离子自由基寿命极短， 目前除了应用脉冲射解技术或快速冰冻结合电子自旋共振(electron spin resonance，ESR)波谱直接获得SOD与超氧阴离子自由基反应的动力学信息外， 一般都采用间接的活力测定法来测定SOD。 下面介绍几种重要的测定方法。 1.1.1　邻苯三酚自氧化法　国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法(简称Marklund法)，Marklund法是采用420 nm处光吸收测定。酶活力定义为：在一定条件下1 mL的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在420 nm波长的自氧化速率达50%的酶量定为1个活力单位。顾孔书等对邻笨三酚自氧化法的测定结果影响因素进行了探讨，结果邻苯三酚自氧化法受到溶液的酸碱性、温度、存放时间及邻苯三酚的浓度的影响。 1.1.2　亚硝酸盐形成法　通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。 1.1.3　极谱氧电极法　极谱氧电极法利用了系统产生超氧阴离子自由基过程中消耗O2，一定量的SOD又会使超氧阴离子自由基歧化产生O2，从而使耗氧量减少的特性，使用极谱氧电极仪精确测出耗氧量而推算出酶活力。SOD活力单位定义为：25 ， pH 8.4，使每分钟产生1 μL O2的SOD量定为1个酶活力单位。张继全等在极谱氧电极法测定超氧化物歧化酶活性的改进一文中，对此方法进行了如下修改：室温测定；酶活性用标准SOD标定；反应在磷酸盐缓冲液中进行；增大邻苯三酚的用量，从而克服了易在电极薄膜表面产生气泡的问题，测定灵敏度及线性范围增大。 1.2 CAT的作用是降解细胞内的H2O2。测定CAT的方法有滴定法、极谱氧电极法等。高锰酸钾滴定法，其原理是定量的细菌同定量的H2O2 发生反应，定时加酸终止反应，尔后用高锰酸钾滴定剩余H2O2量，从而求得细菌H2O2酶的量。唐明忠等在滴定法定量测定细胞菌过氧化氢酶及在肠杆菌科的应用一文中，采用高锰酸钾滴定法定量测细胞过氧化氢酶，结果测得沙雷菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属、哈夫尼亚菌属和产气杆菌的过氧化氢酶活性较高， 普罗菲登菌属、一些沙门菌属、部分肠杆菌属和部分克雷伯菌属的活性居中，埃希菌属、志贺菌属的活性较低。 1.3 GSH Px是一种含硒酶，主要分布在细胞的胞液及线粒体基质中，测定GSHPx活力常用的方法是Hafeman法及其改良法，可以直接测定酶促反应中GSH的减少量，以此来计算GSHPx的活力单位，还可用偶联法测GSH Px活力，但该法对试剂要求较严，难以推广。 2 早在100多年之前，Dubois(18