质粒参考为什么提不出来.doc

我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的Amp。对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp抗性的时候要格外注意。涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。原先测序鉴定没有问题的细菌，37摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：1、 降低培养温度，在20～25下培养，或室温培养可明显减少发生概率。2、 使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。3、 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、 利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。2、 肉眼观察活化菌株。 对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在3716h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、 大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。2、 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。??3、 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。4、 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。5、 溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。6、 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。7、 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。8、 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。9、 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。10、 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60后使用，有利于提高洗脱效率。11、 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。12、 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？参考见解：1、 很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一