2017整理X3-1-2__基因工程的基本操作程序.ppt

* 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步：引物与靶序列退火 * 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步：引物延伸 * 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后：得到两个拷贝的靶序列 * PCR是针对特定DNA片断的快速体外复制增殖技术 每循环一轮，目的基因的量可增加一倍 增殖速率为2n,（n为循环次数） 每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 * PCR技术扩增过程 a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成 。 b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部 。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的 。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 * 从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成 归纳：获取目的基因的方法 DNA合成仪 DNA序列自动测序仪 PCR扩增仪 * 基因表达载体的构建——核心 质粒 DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 * 构建表达载体 组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。 复制原点 插入基因 终止子 抗生素抗性基因 表达载体 启动子 * 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 * 将目的基因导入动物细胞 显微注射法 （将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中） * 将目的基因导入微生物细胞 Ca2＋处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。 将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁和细胞膜的通透性。 * 目的基因的检测与鉴定 检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 功能活性鉴定 抗性鉴定 * DNA分子杂交技术 DNA-RNA分子杂交技术 抗原—抗体杂交技术 检验受体细胞染色体的DNA上是否插入了目的基因 检验目的基因是否转录出了mRNA 检验目的基因是否表达出了蛋白质 个体生物学检验 个体生物学性状观察 * DNA 附着在膜上 硝化纤维素 加探针 报告基因（含荧光素分子） 变性 DNA杂交 （如检测SARS病毒等） a b c d * ①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。 ②检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。 ④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。 提示： ①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； ②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。 * 　　大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 无表达产物 无表达产物 有表达产物 无表达产物 * 归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 * 1.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是 2、下列属于获取目的基因的方法的是 ①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥ * 3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B．有利于对目的基因是否导入进行检测 C．增加质粒分子的分子量 D．便于与外源基因连接 4