2017整理分子生物学的基本竟能和策略.ppt

目的基因及载体的分离 1 目的基因的获取 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 ? 噬菌体载体 50kb ?+ LA RA LA RA EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ lacZ cI 限制性内切酶酶切 切 酶切 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端） 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 平端连接 AGCT TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 重组体的转化 受体细胞 转 JM109感受态 含氨苄平板 Am 重组质粒 感受态 原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型：避免重组整合 转化亲和型：较高的可转化性 遗传互补型：利于筛选 感染缺陷型：防止感染 2）转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 CaCl2处理 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 基因重组 转染 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装 3）转化率：转化细胞/细胞总数 影响因素： 载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程 含氨苄平板 连接 目的基因 基因载体 连接酶 转化 重组体克隆的筛选与鉴定 筛 宿主细胞 转化后的克隆群体： 1遗传检测法 1）抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 2）标志补救（?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 N端序列 LacZ酶 * * 周 俊 宜 生化技术 电泳 层析 离心 分光光度 基因操作 其它 基因工程 分 切 接 转 筛 表 电泳 层析 离心 分光光度 基因操作 其它 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） 基 本