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过氧化氢酶Km值的测定  杨国栋 Nov 2005 一、目的及原理 二、材料与方法 三、结果与分析 * * 1、目的 测定过氧化氢酶的Km值。 2、原理 ① 过氧化氢酶的作用？ ② 过氧化氢酶催化的反应？ ③ 什么叫Km值？ ④ 如何测定过氧化氢酶的Km值？ 1、材料 新鲜的绿豆芽。 2、方法 （1） 酶液提取称取新鲜绿豆芽2g，置研钵中，加约少量（约0.2g) 碳酸钙和约2mL蒸馏水研成匀浆，转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀，静置5min，备用。 （2） Km值测定 ①取三角瓶10个，编号，按照 下表加入各种试剂。表 ④滴定前向各瓶中加入1mL 20%KI 和3滴（NH4）6MO7O24，用0.02mol/L Na2S2O3 滴定至淡黄色时，再加入5滴淀粉指示剂，再用Na2S2O3滴定至蓝色刚消失，记录Na2S2O3消耗总量。 　　　　　　　　　 1、结果 滴定的直接数据。 2、分析 ① 被分解的H2O2（mg）= [空白滴定值(mL)－样品滴定值(mL)]×c ×34.34/2 ② H2O2酶活性 = 被分解的H2O2量（mg） ×酶液稀释倍数 / 样品重（g）×时间（min） 式中：C为Na2S2O3摩尔浓度 34.34为H2O2的摩尔质量 ③ Km值计算： 以不同底物浓度为横坐标，以相应酶促反应速度为纵坐标， 以双倒数作图法求出H2O2酶的Km及Vmax. Thank you End ① 过氧化氢酶的作用？ 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系。 生物体内的某些代谢物由于需氧脱氢的结果，而产生对机体有毒害作用的过氧化氢，过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和分子氧，使过氧化氢不致在体内积累，因此，过氧化氢酶具有保护生物机体的作用。 return ② 过氧化氢酶催化的反应？ E + H2O2 E-H2O2 E-H2O2 + AH2 E + 2H2O + A E-H2O2 + H2O2 E + 2H2O + O2↑ 过氧化氢酶 return 什么叫Km值？ 酶促反应的反应速度达到最大反应速度的一半时，所需要的底物浓度即为Km值。 return 如何测定过氧化氢酶的Km值？ 采用双倒数作图法求得Km值。 即底物浓度的倒数和在此底物 浓度下的酶促反应速度。 首先加入过量的H2O2剩余的H2O2用碘量法定量测定，以钼酸铵作催化剂，使H2O2与KI反应，放出游离I2，再用Na2S2O3滴定I2，反应为： H2O2 + 2KI + H2SO4 I2 + K2SO4 + 2H2O I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 。 return [S] 1 图13-1 双倒数作图法求Km值 return 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 钼酸铵（滴） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 20%KI(mL) 5.0 0 5.0 0 5.0 0 5.0 0 5.0 0 1.8mol/L H2SO4(mL) 混匀，室温，准确5min 50 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 1.0 1.0 0.05mol/L H2O2(mL) 0 0 1.0 1.0 2.0 2.0 3.0 3.0 4.0 4.0 蒸馏水（mL） 0 5.0 0 5.0 0 5.0 0 5.0 0 5.0 1.8mol/L H2SO4(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 酶液（mL） 5’ 5 4’ 4 3’ 3 2’ 2 1’ 1 瓶 号 试 剂