海洋生物毒素的提取案例.ppt

海洋生物毒素的提取、分离和鉴定 ---------------------以麻痹性贝毒、河豚毒素为例 一、麻痹性贝毒 1、来源 有害赤潮特别是有毒赤潮对人类生命健康和海洋生态系统的威胁日益严重，已引起人们的广泛关注。有毒赤潮藻类可产生多种毒素，这些毒素可通过食物链在贝类或鱼类等生物体内累积放大，当人们误食这些染毒的海产品时，就会发生中毒死亡，因此，这些毒素又常被称为贝毒素或鱼毒素。 2、作用机理 麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)是一类阻断神经细胞钠离子通道，对人体神经系统产生麻痹作用的海洋生物毒素。该毒素对人体毒性极强，且无特效解救药物，对人类健康影响很大。我国近海多种可食用贝类中均含有麻痹性贝毒，福建省东山县广东省大亚湾及台湾省近年都发生因食用染毒贝类而引起多人中毒死亡事件! 3、物理化学性质 a、通常情况下，PSP毒素化学性质比较稳定，但在碱性水溶液中容易发生分解; b、在强酸性水溶液中，部分毒素容易发生转化，例如N一磺酞氨甲酞基类毒素在加热、强酸性条件下会脱掉磺酞基，生成相应的胺基甲酸醋类毒素。 c、在pH为2-4，尤其pH=3时毒素最为稳定，在一18℃以下能够较长时间保存; d、麻痹性贝毒本身紫外吸收很弱，且不能产生荧光，但其在碱性条件下氧化再酸化能生成荧光物质，这种性质成为PSP荧光检测的主要依据。 4、提取、分离和检测技术 ①样品采集 扇贝采集，样品采集后现场用水冲净外壳，并用不锈钢刀打开，将贝肉、性腺和消化腺分离，用纱布吸除多余水分，然后冰块保存运至实验室，- 20 度贮存。 ②提取 贝类PSP的提取方法主要采用AOAC法，该方法简单描述为: a、在称重的烧杯中称取100g均质的样品，加0. lmol/L HCl溶液100mL充分搅拌，检查pH (pH应为2. 0-4. 0，以3最佳)。需要时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或0. lmol/L NaOH溶液调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素。 b、将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节pH至 2. 0-4. 0(勿4. 5)。 ③分离 将混合物移至量筒中并稀释至200mL。将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状。利用超速离心机，将混合物或上清液以3 000r/min离心5min。或者用滤纸过滤。 ④鉴定方法 a、小白鼠生物检测法 PSP的小鼠生物法检测程序已由美国分析化学家协会(AOAC)标准化(AOAC,1990)，并在世界范围内被广泛接受。虽然小鼠生物法操作简单、能反应样品总的毒性，但也有很多不足的地方，如只能检测毒性大小，而无法确定毒素的种类和含量;小鼠的不同品系、批次、大小对毒素的测定的灵敏度有很大的影响;实验结果可重复性、可比性差。 b、高效液相色谱法(HPLC)分析 高效液相色谱法(HPLC)又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱、近代柱色谱等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 c、细胞毒性检测法 根据离子通道类毒素可以专一性地作用于细胞膜离子通道的特点建立起来的细胞毒性检测技术，可以快速敏感的检测毒素。它是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素存在与否以及毒性大小的一种技术，可以直接体现所测样品的毒性状况。 麻痹性贝毒（PSP)可以作用于Na+通道的1位点，阻断Na+内流，当在培养的细胞中加入Na+通道活化剂，细胞会由于Na+内流过多而造成肿胀，甚至死亡，但如果同时加入具Na+通道阻断作用的毒素PSP, Na+内流会因拮抗作用而受到限制，使得细胞成活，由此可以确定毒素的存在，并根据细胞的成活率对毒素进行定量分析。 针对PSP的仪器检测方法还有液相色谱一质谱联用，毛细管电泳法，流动注射法等，但都因灵敏度低或毒素组分分离度差等原因而未能得到广泛使用。 二、河豚毒素 1、河豚简介 河豚鱼(Balloonfish )，属硬骨鱼纲、鱿形目。世界上有200多种，可引起中毒的有9种。河豚主要分布在渤海、东海、黄海及江河下游，为近海与河川底层肉食性海产有毒鱼类。河豚鱼肉质细嫩、鲜美，曾有“拼死吃河豚”之说，吃河豚中毒死亡者，在国内外屡见不鲜，就是食用河豚经验比较丰富的日本人，据说每年中毒死亡者也有几百人之多。 2、河豚毒素简介 70年代成功的从河豚鱼体内有毒部位(卵巢、精巢、肝脏、脾、胃、肠等)分离提纯河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)。TTX是一种结