第3章细胞生物学方法分解.ppt

* RNA-Mediated Gene Silencing * 未来的生物技术 * 概念： 分辨率 细胞融合 细胞系 传代（继代）细胞培养 简述单克隆抗体技术及其技术路线。 哪些显微技术可用于活体细胞动态观察？ * 第三章 细胞生物学研究方法 * 现代细胞、分子生物学研究的模式生物： Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana 常见的模式生物: 真菌中的酵母， 原核生物中的大肠杆菌， 低等无脊椎动物中的线虫， 昆虫纲的果蝇， 鱼纲的斑马鱼， 哺乳纲的小鼠, 植物中的拟南芥。 * 第三章 细胞生物学研究方法 ?细胞形态结构的观察方法 ?细胞组分的分析方法 ?细胞培养、细胞工程、分子生物学技术 * 第一节 细胞形态结构的观察方法 ?光学显微镜技术（light microscopy） ?电子显微镜技术 (Electro microscopy) ?扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) * 一、光学显微镜技术（light microscopy） 分辨率（即分辨极限, D）是指区分开两个质点间的最小距离. 习惯说的分辨率高则是指该分辨极限小； 人眼的分辨率：0.2 mm，光学显微镜的最大分辨率：0.2 ?m. 放大倍数: 光学显微镜在用空气作介质时,最大放大倍数为1000倍,用油镜时为1400倍. 波长、介质折射率、物镜镜口角 * 一、光学显微镜技术（light microscopy） ?普通复式光学显微镜技术 ?相差显微镜（phase-contrast microscope） ?微分干涉显微镜（differential-interference microscope） ?荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） ?激光共聚焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） * 普通复式光学显微镜 * 倒置显微镜 * 普通光学显微镜： 观察单细胞生物或体外培养细胞，染色的组织切片。 颜色 相差显微镜： 观察未染色活细胞，细胞核、线粒体等细胞器的动态。 密度 微分干涉显微镜：观察活细胞中较大的细胞器。 厚度 * 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） ?直接荧光标记技术 技术原理： ?间接免疫荧光标记技术 ?在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 Green fluorescence protein 美籍华人科学家钱永健（Roger Qian)等3人 因对GFP及其突变体进行研究和应用而获得2008年诺贝尔化学奖 * * 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） ?原理：物镜和聚光镜同时聚焦到同一点 ?应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率，通过改变焦平面，可重构样品的三维结构。 主要用途： 1．细胞及生物荧光样品观察分析。 2．绿荧光蛋白分析。 3．荧光原位杂交分析。 4．光切片扫描。 5．3D图像处理。 6. 时间序列拍摄成像. * 二、 电子显微镜技术电子显微镜的基本构造 * 与电镜相关的技术 ?超薄切片技术：固定，包埋，切片，染色 ?负染色技术： 染色背景，衬托出样品的精细结构 ?冰冻蚀刻技术： 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 ?电镜三维重构技术： 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 ?扫描电镜技术：主要用于观察样品表面的形貌特征 * 电镜样品的制备 * 第二节 细胞组分的分析方法 ?离心分离技术 ?细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 ?特异蛋白抗原的定位与定性 ?细胞内特异核酸的定位与定性 ?放射自显影技术 ?定量细胞化学分析技术 * 2.1 用超速离心分离细胞器与生物大分子 差速离心： 密度梯度离心：蔗糖、多聚蔗糖、氯化铯 速度沉降： 密度相近，大小不一 等密度沉降：不同密度 * 2.2 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂