第五章目的基因的获取幻灯片.ppt

第五章 目的基因的获取 化学合成法 PCR技术 筛选基因文库 转座子标签法 mRNA差别显示技术 生物信息技术分离和鉴定 酵母双杂交系统分离 （一）化学合成法的单元操作 从反应机理上分为：磷酸二酯法、磷酸 三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法 操作过程：液相合成 固相合成 亚磷酸三酯法合成过程 1、小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 2、补丁延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段 3、大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段 （三）DNA化学合成的用途 合成天然基因:胰岛素基因、干扰素等； 有些基因比较短，化学合成费用较低。 修饰改造基因，设计新型基因。 “人造儿” 2010，5.20， 美国64岁科学家 10年耗资4000万美元 用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因后导入到支原体细菌，DNA象正常细菌的基因一样进行复制－人造生命诞生。 制备探针、引物、接头 定点突变合成：合成带有定点突变的基因片断。 二、PCR技术获得目的基因 反转录PCR：RT-PCR，以mRNA逆转录合成的cDNA第一条链为模板的PCR。 引物：基因边码区引物，oligo（dT）12-18， 氨基酸序列设计特异引物：简并引物 反向PCR：根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术。 三、筛选基因文库(gene library) 基因库（gene pool）：特定生物体全基因组的 集合（天然存在）。每个种群都具有其独特的基因库。 基因文库（gene library or gene bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。 （一）基因文库的容量和完备性 在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： N=ln（1-P）/ln（1-f） P=任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率 f=克隆片段的