重组DNA技术精简版幻灯片.ppt

基因重组与基因工程 Gene recombination and genetic engineering 孙庆涛 刘华明 2011.3.16 重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆（molecular cloning）。 基因工程的操作过程主要由以下步骤组成： ①载体和目的基因的分离 ②载体和目的基因的切断 ③载体和目的基因的重组 ④重组DNA的转化和扩增 ⑤重组DNA的筛选和鉴定 一、载体和目的基因的分离 为了进行基因重组，首先需要对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。 （一）载体： 基因工程中常用的载体(vector)主要包括 质粒(plasmid) 噬菌体(phage) 病毒(virus) 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 1．质粒： 2．噬菌体： 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。 3．病毒： 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。 （二）目的基因： 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1．直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。 3.从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 4．从基因文库中筛选： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G-文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。 5．利用PCR合成： 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 二、载体和目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 三、载体和目的基因的重组 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 （一）粘性末端连接法： 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。 （二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 （三）人工接头连接法： 将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 五、重组DNA的筛选和鉴定 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行： （一）根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青