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DNA序列多态性常用检测技术
第六章 DNA 序列多态性 人类基因组DNA序列差异是个体间最本质的差异。 在特定基因座位,不同个体、不同等位基因之间由碱基序列差异构成的DNA多态性称为 DNA 序列多态性 (sequence polymorphism)。 同一个体不同组织、器官的细胞中基 因组DNA序列一致,是法医学个体识别鉴定的基本前提。 DNA 序列多态性常用检测技术: 1)序列测定 2)斑点杂交技术 3)PCR-RFLP技术 4)序列特异性PCR技术 5)其他:SSCP, MVR-PCR 新技术:DNA芯片技术 DHPLC技术 MALDI-TOF-MS技术 DNA 序列测定 DNA序列测定(DNA sequencing) 是对 DNA分子一级结构的分析。从多态性的概念分 析,序列测定的靶位点碱基种类,实质是SNP:在 特定的染色体、特定的靶位点上,不同个体、不同 等位基因的碱基种类。 一、双脱氧核苷酸 链终止法测定原理 经典的核酸序列测定方法有: Sanger 双脱氧核苷酸链终止法 Maxam化学降解法 DNA复制的基本条件: ▲单链DNA模板 ▲DNA聚合酶 ▲寡核苷酸引物 ▲dNTP合成原料 基本过程: 1)引物与模板退火形成双链区。 2)DNA聚合酶结合并启动引物延伸。 3)dNTP按照碱基配对原则逐个连接在引物的3’端,以5’→3’方向延伸合成一与模板互补的DNA新生链。 1.DNA聚合酶与模板结合,在模板链上移动方向:由模板的3’→5’;引物延伸方向是5’→3’。 2.dNTP按照碱基配对原则,连接在引物3’末端。 3.新合成链碱基与模板对应碱基间以氢键连接;连接引物末端与新连接的碱基之间是磷酸二酯键。 磷酸酯键 连接 在DNA合成体系中如果加入2’,3’-ddNTP,当ddNTP按照碱基互补原则连接到引物3’端,该最后一个碱基没有3’-OH ,无法连接后续的dNTP,使该引物链终止在这个碱基位置上,不再延伸。 由于反应体系中还加有dNTP,与ddNTP形成竞争状态。引物末端连接有dNTP者,可以继续延伸。最后DNA合成的产物是一系列具有不同ddNTP终端的新合成DNA链。 例如,在反应体系中加dCTP和ddCTP: 设置一套四组反应体系:A,T,G,C: 每组除正常反应需要的dNTP外,分别加入:ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP。 复制产物经过电泳后,直接银染显带,或采用同位素标记放射性自显影,或者四组引物分别用4种荧光染料标记。 经过DNA合成反应后,由ddNTP终止的不同长度的新生DNA片段。然后分四泳道分离。检测被终止DNA片段长度并确定碱基种类,可以直接读出DNA序列。 自动循环测序技术: 利用PCR技术,以靶片段为测序模板,反应体系中同时加入有dNTP和ddNTP,PCR产物是不同长度的被终止片段。 标记方式:多采用:Dye-terminators。如果4种ddNTP分别 标记不同的荧光: (例如:A-绿、C-红、G-蓝、T-黄) 荧光染料基团标记的 基本特点: ▲激光诱发吸收光谱在可见光范围。 ▲不影响引物延伸反应。 ▲不影响标记后DNA片段的电泳性质。 ▲4种荧光的吸收和激发波长有足够的差异。 四组反应安排在同一管中进行。循环测序只需要一条引物,模板DNA以线性方式扩增,引物延伸分子以不同碱基对应位置终止的片段。 电泳技术的检测灵敏度要求高,必须能够区分相差一个碱基对的DNA片段。 毛细管电泳自动检测目前是常规检测技术 读序原则与依据:▲荧光波长(颜色),判定引物链终止在哪一种核苷酸,▲由DNA片段电泳通过激光检测窗口的即时时间判定片段长度。 从电泳图谱可以直接读出模板的碱基序列。 二 等位基因特异性探针杂交技术 Allelic specific oligonucleotide (PCR-ASO
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