《基因工程原理》中国农业科学院研究生院复习题.docVIP

中国农业科学院究生院 《基因工程原理》复习题 20世纪70年代诞生基因工程的理论基础和技术基础是什么？ 答：理论基础： ①在40年代确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题； ②在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题； ③在50年代末和60年代相继提出了中心法则和操纵子学说，成功地破译遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。 技术基础： ①用核酸内切限制酶和DNA连接酶进行DNA分子的体外切割与连接技术； ②克隆载体构建技术； ③大肠杆菌转化体系的建立； ④DNA分子的核苷酸序列分析技术； ⑤核酸杂交技术； ⑥琼脂糖凝胶电泳技术。 何为DNA克隆？其主要的实验步骤。 答：DNA克隆又称基因克隆，是指将外源基因插入到克隆载体上形成重组DNA分子群体，并转化到寄主细胞中进行复制，以便于分离纯化目的基因或特定的DNA片段的实验操作。 主要步骤： ①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； ②体外将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标记的载体分子上，形成重组子DNA分子； ③将重组子DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； ④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆； ⑤从这些筛选出的受体细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； ⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 说明mRNA差别显示分离产物未知基因的基本原理并评述其优缺点。 答：原理： ①几乎所有的真核基因mRNA分子的3′-末端都有一段poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝； ②根据mRNA分子3′-端序列结构分析，在这段poly(A)序列起点碱基之前的两个碱基，除了倒二位的碱基为A的情况之外，只能有12种可能的排列组合； ③根据上述mRNA分子结构特征设计的，用以反转录mRNA合成第一链cDNA的下游引物，共12种，其通式为：5′-T11MN或5′-T12MN。每一种此类人工合成的3′-端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂种分子。因此，用5′-T11MN引物或5′-T12MN引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的位序列结构不同的12个分亚群体。 ④由于3′-端锚定引物合成的第一链cDNA群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的，所以要把一种只在某一发育阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要进行PCR扩增，因此在DDRT-PCR反应中还需5′-端随机引物。 优点： ①可以同时比较多个样品间基因表达的差异； ②可以同时检测到“上游”及“下游”基因； ③检测的灵敏度高，所需样品少，一些低丰度的mRNA亦可被检测出来； ④结合使用PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本法更加简单方便。 缺点： ①假阳性比较高，通常可高达50%-70%； ②扩增条带的分子长度比较短小； ③工作量大。 一种基因产生多种蛋白质的原因分析。 答：主要原因： ①许多基因都有多个启动子。在真核断裂基因的转录过程中，可变启动子的使用常涉及到位于转录起点的可变首位外显子，每个可变首位外显子都具有一个专有的启动子，可变首位外显子的不同导致翻译出的蛋白质也不同。 ②初级转录本的可变剪接。真核断裂基因的初级转录本，在不同类型的细胞或不同发育阶段的细胞中会发生不同形式的剪接作用，生成具有不同序列结构特征、编码不同蛋白质异形体的成熟mRNA分子。 次要原因： ③RNA的编辑。RNA的编辑具有多种不同的效应，比如产生新的起始密码子、终止密码子或多肽链编码序列出现变化，因此改变了源自基因DNA模板链的遗传信息，翻译出不同的蛋白质多肽。 ④基因重排。基因区段的转位作用或随机连接会造成基因可变区固有排列顺序的改变或DNA重排，可使基因产生不同的蛋白质。 影响酶切反应的因素及产生酶切星号活性的分析 答：影响因素： ①DNA分子的性质: a. 酶切位点周围的碱基成分； b. 酶切位点的密度； c. DNA分子的构型； d. DNA分子的甲基化程度； ②酶切的温度； ③DNA制剂的纯度。 产生酶切星号活性的分析： ①酶用量与DNA样品的比值过高； ②甘油浓度过高； ③二价金