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遗传病的分析4基因组DNA提取与PCR扩增技术 一、基因组DNA提取 实验目的 基因组DNA的制备是基因分析的前提。 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。 原 理 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子键、氢键、范德华力等，破坏或降低这些结合力就可把核酸与蛋白分开。 DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm处，所以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。 原理 基因组DNA提取试剂盒：在高盐的状态下，DNA纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。 器材与试剂 台式高速离心机、天平、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等 试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙醇、离心纯化柱 ）、TE缓冲液 操作 1、将全血轻轻混匀，转移0.5ml全血到1ml纯化树脂中，颠倒混匀5-6次，室温，3min。其间要颠倒混匀1次，5000r/min离心×3sec； 2、取沉淀，加1mlGN结合液悬浮沉淀，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec； 3、取沉淀，加0.5ml漂洗液纯化树脂2次，颠倒混匀， 5000r/min离心×3ecs； 4、取沉淀， 加0.8ml无水乙醇悬浮沉淀，颠倒混匀；装入离心纯化柱，12000r/min离心×1min，弃乙醇液； 5、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液； 6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加入100ul TE缓冲液于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3min，12000r/min离心×2min。 注意事项 一般情况下，纯净的DNA OD260/OD280比值约为1.8，RNA为2.0。若样品中含蛋白质，则比值下降，必要时需重新抽提。若DNA的比值1.75，则加入SDS至0.5%； 从核酸中去除蛋白质时，常用到酚：氯仿等体积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离； DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长期保存。 二、PCR扩增技术 实验原理 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。可简述为： 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物，并有Mg2+存在。 实验原理 加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。 降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。 溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。 如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。 实验原理 实验目的 本实验以所提出的全血基因组DNA为模板，以线粒体基因上一段核苷酸为引物，扩增出924bp的扩增产物。学习并掌握PCR 反应的基本原理与实验技术。 器材和试剂 器材 PCR扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等 器材与试剂 试剂： 1、PCR试剂盒： （Taq DNA 聚合酶、 dNTP 、Mg＋＋等 ） 2、引物 1（68kb上游） 引物 2（69kb下游） 3、无菌ddH2O 4、模板DNA：为本次实验所提出的全血基因组 DNA 操作 无菌ddH2O 21.5ul Taq酶等 25ul 引物1（68） 0.6ul 引物2 （69） 0.9ul 模板DNA 2ul 混匀后，离心5000r/min×1min，置PCR仪 操作 PCR扩增的设定： 设置PCR扩增仪的热盖温度为100℃ 预变性：94℃5min 循环： 94℃变性30s 56℃退火30s 30个循环 72℃延伸30s 末次延伸：72℃ 5min 4 ℃保存 注意事项 由于PCR技术非常敏感，可使一