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半夏曲炮制过程中优势微生物的鉴定 　　[摘要] 研究半夏曲不同发酵时间点的微生物种类、数量变化以及优势菌种的分离鉴定，为探讨半夏曲炮制机制奠定基础。用选择性培养基对半夏曲发酵过程中5个时间点（0，18，36，54，72 h）样品中的细菌、霉菌、酵母菌分别进行培养、菌落计数、分离纯化优势菌种；采用16S rDNA，26S rDNA序列分别对优势细菌、优势真菌进行鉴定。结果表明，半夏曲发酵过程中细菌数量少、变化平缓，而酵母菌和霉菌数量发酵至54 h时迅速增加，至发酵结束时达1×107 CFU?mL-1以上；通过NCBI同源性比对及构建系统发育树，鉴定出半夏曲炮制过程中的优势细菌为Streptomyces sp.，Bacillus pumilus，B. subtilis，B. aryabhattai，Bacillus sp.；优势酵母菌为Meyerozyma guilliermondii；优势霉菌为Paecilomyces variotii，Byssochlamys spectabilis，Aspergillus niger。提示半夏曲的发酵过程涉及多种微生物共同参与，其中以酵母菌和霉菌为主。M. guilliermondii，P. variotii，P. variotii，A. niger 和Bacillus sp.等优势菌种可能在半夏曲炮制中起重要作用。 　　[关键词] 半夏曲； 发酵； 优势菌种； 16S rDNA和26S rDNA； 系统发育树； 菌种鉴定 　　半夏曲是临床上常用的中药炮制品之一，为清半夏、六神曲、生姜汁、面粉、白矾发酵而成。半夏曲含有酵素等， 具有祛湿化痰、降逆止呕、健脾温胃的功能， 用于治疗心下痞满， 不欲饮食， 倦怠乏力， 大便不调[1]。半夏曲的现代研究侧重处方筛选、化学成分等，对于半夏曲炮制中起重要作用的微生物研究甚少。目前，仅蔡清宇等[2]初步表明生半夏曲中含较多杂菌，在血平板培养基中培养出革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌及球菌，在沙氏培养基中未培养出真菌。本实验对半夏曲发酵炮制过程中不同时间点的微生物菌群种类和数量变化进行初步研究，并分离鉴定优势菌种，研究结果将为揭示半夏曲炮制机制奠定基础。 　　1 材料 　　1.1 仪器 　　MILLIQ超纯水仪（美国Millipore公司）；培养箱（上海一恒科技有限公司）；PTC200 PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪（美国伯乐公司）；I16K高速低温离心机 （Sigma公司）。 　　1.2 试剂 　　硫酸链霉素、琼脂粉、溶菌酶购自北京索莱宝；脑心浸液肉汤培养基、马铃薯葡糖糖琼脂购自青岛海博，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（自配）；植物基因组DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、酵母菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR master Mix购自北京天根；溶菌酶缓冲液、PCR引物购自上海生工；琼脂糖购自Innvitrogen公司；DM2000 Marker购自康为世纪公司。 　　1.3 供试样品 　　半夏曲炮制过程中不同时间点样品由成都中医药大学提供。 　　1.4 引物 　　细菌16S rDNA基因通用引物序列，27F：5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′；1492R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′。真菌26S rDNA基因通用引物序列[3]，NL1： 5′GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA G3′；NL4： 5′GGTCCGTGTTTCAAGACGG3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　2 方法 　　2.1 半夏曲的制备（由成都中医药大学制备） 　　参照中药部颁标准。清半夏 160 g、白矾 10 g、 六神曲 5 g、生姜汁20 g、面粉 32 g，除生姜汁、面粉外，其余3味粉成细粉；生姜汁加水适量，与面粉及上述细粉搅匀，制成粗粒软硬适宜的小块或颗粒，发酵，干燥。分别取发酵0，18，36，54，72 h的样品于无菌的密封袋中4 ℃保存，并在3 d内完成不同种微生物的培养计数。 　　2.2 微生物的培养及菌落计数 　　取5个炮制时间点的样品各1 g于无菌的小锥形瓶中，加入9 mL的无菌生理盐水在水平摇床摇匀，取配好的样液1 mL加入9 mL的无菌生理盐水，依次进行梯度稀释为1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，根据不同取样点的样品菌落数选取合适的3个稀释梯度（1×10-1，1×10-2，1×10-3）。取100 μL稀释液注入平皿固体培养基上，用涂布器涂布均匀，每个稀释度做3个重复。细菌培养皿置于37 ℃培养箱培养1～2 d。霉菌和酵母菌培养皿置于28 ℃培养箱培养3～4 d。菌落的