免疫酶技术__培训课件.ppt

七. 应 用 (包括所有标记技术) (一)病原体的诊断及研究 1.病毒、细菌等传染病的诊断 (测抗原或抗体) 2.病毒、细菌表面抗原的研究 (二)某些疾病的诊断 1.某些微量物质有关疾病的诊断 2.肿瘤的诊断及定位 3.自身抗体检测协助自身免疫病诊断 4.寄生虫疾病的诊断等 (三)免疫学方面的研究 T、B 细胞的发生、演化、 表面 抗原改变等的研究 (四)微量物质的检测 体内:微量蛋白质、激素、酶 等抗原;药物、糖等半抗原 工农业:微生物、微量物质等 思考题： 1.ELISA 的原理、方法（以间接法测抗体和双抗夹心法为例）及影响因素。 2. ELISA试验应设哪些对照，为什么？ 3.判断ELISA试验结果的方法。 发光免疫技术 发光免疫技术是将发光 系统与免疫反应相结合，来 检测抗原、或抗体的方法。 化学发光免疫测定 一.化学发光酶免疫测定（chemiluminescent enzyme munoassay，CLEIA) 试验前部分与ELISA一样，改变所加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果。 如酶是用辣根过氧化物酶， 常用底物是鲁米诺或其衍生物。 二.化学发光标记免疫测定 （chemiluminescent munoassay，CLIA) 是用化学发光剂作为标记物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。 金免疫技术 采用胶体金作为标记物 胶体金又称金溶胶，是金盐(氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后形成的金颗粒悬液 胶体金的特性： 1.胶体金性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，1~100nm 2.呈色性：颜色与颗粒大小有关 2~5nm 橙黄色 10~20nm 酒红色 30~80nm 紫红色 一.斑点金免疫渗滤试验 （dot immunogold filtration assay，DIGFA) 原理：采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根据在膜中央形成的红色斑点（胶体金聚集）有无来判断结果。 技术类型：双抗体夹心法（测Ag)； 间接法(测Ab) 二.斑点免疫层析试验 （dot immunochromatographic assay，DICA) 以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析 1:鼠抗人HCG抗体 2:羊抗鼠IgG 尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物； 随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色 HCG金标试纸 带条中均匀含有胶体金标记的鼠抗人HCG单抗 在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗(IgG)随着尿液上行,到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质控对照。 思考题： 1.发光免疫技术、金免疫技术的原理 2.用金标记免疫法（斑点免疫层析试验）检测HCG的原理 步骤：包被抗体A＋待测标本 ＋酶标抗体B ——洗涤，＋底物——终止液，观察结果 （检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位） 该法是一次性加入标本和酶标抗体，试 验程序简单，提高了检测的特异性 用于检测Ag , 且Ag是具有至少2种抗原表 位的多价抗原 反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内） （四）竞 争 法 步骤： 待测管：已知Ab包被＋待测标本（Ag？）—— 洗涤，＋酶标Ag——洗涤，＋底物——显色 先加 先加 （五）应用亲和素和生物 素的ELISA 亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合 生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定 亲和素 生物素 生物素 生物素 生物素 亲和素— 生物素在ELISA中使用： 三.ELISA结果的判定 （一）肉眼判定 与阳性、阴性对照颜色比较： 结果判定 2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性； 3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。 1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性； （二）酶标光度仪检测A492值 （吸光率）：比色法 1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0