免疫电镜细胞化学技术__培训课件.ppt

3、假复型技术： 琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，以假复型的形式转移到火棉胶膜上或Formvar膜上。 此种方法：能去除标本中的盐分、浓缩病毒；减少不必要的杂质；比较费时。 方法： 1）将20%的琼脂糖块放到载玻片上，滴上含病毒的悬液，将它放到紫外灯下照射消毒，直到悬液被琼脂吸干。 2）在琼脂块的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用滤纸片吸走。 3）用刀片将琼脂块的边缘切除（为便于剥离）轻轻将载有琼脂块的载玻片浸入PTA或醋酸铀溶液中，并把Formvar膜剥离和漂浮到染液水面上。 4）将铜网放到剥离到水面上的 Formvar膜上。 5）用不锈钢小柱把铜网膜同Formvar膜一起打捞出来，即可进行电镜观察。 4、病毒颗粒免疫电镜技术： 病毒颗粒与其外周相伴随的结构成分杂质或人工损伤产物混淆不清。 特别是肠道病毒与粪便中成分难以分辨。 这种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒颗粒包被、凝聚起来。 病毒颗粒经过特异性的抗体结合并凝聚成团之后，在负染色下显示出病毒结构， 或包被在病毒颗粒表面的抗体，形成抗体桥，这种电镜技术称作免疫电镜技术。 样品制备步骤： 取0.9ml病毒悬液加0.1ml 1：10稀释的 恢复期病人血清充分混匀 ↓ 37℃1小时后，置4℃冰箱过夜 ↓ 然后用琼脂扩散法或假复型法制作 电镜标本 ↓ 负染色后，电镜检查 根据抗体凝聚的病毒颗粒的多少和程度以（+）表示。 如果检查不到抗体包被的病毒颗粒，可离心，将沉淀重悬浮于1-2滴蒸馏水中，再用同样方法滴膜、负染。 利用免疫电镜技术发现和鉴定了许多重要的病毒。 免疫电镜细胞化学技术 电镜细胞化学技术 电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。 目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。 免疫电镜技术 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一种方法。 目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗铁蛋白电镜复合物技术。 用以标记抗体的酶要具备以下条件： 1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。 2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。 3.在体液或组织中不存在该酶的底物。 酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP） 电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则 1、取材与固定 取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。 （1）2%多聚甲醛液 （2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛 （3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛  2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8μm ，震动切片20～80μm。 3．漂洗后的厚切片可按免疫组化步骤进行标记染色。 4．DAB显色后再进行锇酸后固定以及电镜包埋切片处理。 5. 如果确定待测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色。 三、免疫染色 包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后再进行脱水包埋超薄切片。 优点：（1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理，对抗原性破坏较小。（2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检出率.（3）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保存。 包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。 优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不需要穿透剂。 2.免疫染色 ① 直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。 ② 间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反