第5章基因工程基本流程-筛选与鉴定范例.ppt

选择过程 从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 分子量 Marker 载体 重组 克隆 * 7. 限制性酶切图谱法 限制性酶切图谱：核酸经限制性内切酶消化成片段，用电泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱。 * 在外源片段大小及限制性酶切图谱已知的条件下，选择一两种内切酶切割载体，电泳后比较电泳结果(DNA条带数目和分子大小）差异进行区分。 或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。 原理： * A B A或B * 不同克隆的酶切结果 * 选择过程 * 8. DNA序列测定 原理： 通过对插入片段序列的测定确定是否是所需的重组子 * 选择过程 双脱氧末端终止法 化学降解法 焦磷酸降解法 高通量Solexa测序 …… * * 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 1. 蛋白质功能检测 原理： 外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应的检测方案 针对表达载体的检测方法 * 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 * 选择过程 弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的培养基中生长 * 例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。 DHFR 载体 连接 转化受体菌 三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板 含DHFR的克隆才能生长 2) 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 * 3) 酶活性检测 针对外源基因表达产物是酶。 ①扩散免疫沉淀检测分泌型产物 原理：抗原——抗体凝集反应 方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 * * ②酶联免疫吸附测定（ELISA） 原理： 一抗（primary antibody）：与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linked）二抗： 携带能催化无色底物转变为有色物质（或发光）的酶，再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 * 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 * 方法： 固定样品 一抗结合 二抗结合 显色/发光反应 比色 2. 放射免疫原位检测 利用抗体作为“探针”原位检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 蛋白——蛋白杂交 原理： * 选择过程 * 3. western blotting 蛋白——蛋白杂交 原理： * 选择过程 western blot过程 多抗Blotting结果 单抗blotting结果 * 4. 蛋白凝胶电泳 待筛选克隆与非重组子同时进行蛋白质电泳，电泳结束后通过染色对比相应条带辨识重组子。适合受体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系。 原理： * * 选择过程 SDS，染色 不适于筛选 5.转译筛选法 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 原理： * * 选择过程 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的 甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比较放射性 带纹的位置 载体+外源DNA 转录 与预期的产物分子量相符？ 6. DNA-蛋白质相互作用筛选 检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 ChIP 、EMSA、甲基化干扰实验…… * * 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 原理： 一般克隆与筛选策略 * 第5章基因工程基本流程——筛选与鉴定 1. 抗药性筛选法 pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。 基于载体遗传标记的筛选与鉴定 原理： * * * （1）四环素： （2）氨苄青霉素抗性基因： pBR322抗生素标记选择 产生?-内酰胺酶，