16生物化学实验--醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶.docVIP

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶 【目的】 1 ． 掌握电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的原理与技术。 2 ． 熟悉测定血清乳酸脱氢酶同工酶的临床意义。 【原理】 体内 LDH 同工酶均由四个亚基组成。亚基分二种，即 “ H ” 亚基（多分布于心肌）与 “ M ” 亚基（多分布于肌肉）。根据亚基不同， LDH 同工酶分为以下五种（表 3-8 ）。 表 3-8 LDH 同工酶的分类与组成 分类 亚基组成 LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 6 H H H H(H 4 ) H H H M(H 3 M ) H H M M(H 2 M 2 ) H M M M(HM 3 ) M M M M(M 4 ) 由于 LDH 同工酶的亚基组成不同，在 pH8.6 巴比妥缓冲液中所带电荷不同，通过醋酸纤维薄膜电泳可以将血清样品中的各种 LDH 同工酶彼此分开。 以乳酸钠（钾）为基质，在有氧化型辅酶 Ⅰ 存在时， LDH 可是乳酸脱氢生成丙酮酸、使 NAD + 还原为 NADH+H + ， NADH+H + 又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐（ PMS ）， PMS 再将氢传递给氯化硝基四氮唑蓝（ NBT) ，使其还原为紫蓝色化合物，因此有 LDH 活性的区带即着紫色，生成颜色深浅与 LDH 活性成正比。其反应如下： 将电泳后的 醋酸纤维薄膜与含有底物乳酸和显色剂的染色液一起保温，便可显示出血清 LDH 同工酶的谱带（图 3-8 ）。将各谱带洗脱进行比色分析，即可求得各同功酶的相对百分比。 图 3-8 LDH 同工酶电泳图谱 【器材】 1 ． 电泳仪 2 ． 电泳槽（用二层滤纸或纱布搭桥） 3 ． 恒温水浴 4 ． 分光光度计 5 ． 点样器 6 ． 白瓷盘 7 ．玻璃板 8 ．镊子 【试剂】 1 ． pH8.6 巴比妥电泳缓冲液（离子强度 0.05 ） 巴比妥钠 20.6g ， 巴比妥 3.68g ， 蒸馏水加至 2 000ml 。 2 ． pH7.5 磷酸盐缓冲液（ 0.1M ） 磷酸二氢钾 2.16g ， 磷酸二氢钠 30.13g ， 蒸馏水加至 1 000ml 。 4 ℃ 冰箱保存。 3 ． 吩嗪二甲酯硫酸盐液 吩嗪二甲酯硫酸盐 0.5g ， 蒸馏水加至 500ml 。 4 ． 氯化硝基四氮唑蓝液 氯化硝四氮唑蓝 1.25g ， 加入 pH7.5 的磷酸盐缓冲液至 300ml( 温水助溶过滤 ) 。 5 ． 1M 乳酸钠液（或 0.5M 乳酸钠液） 取 70% ～ 80% 液体乳酸钠 8ml ，加水至 200ml 为 0.5M 乳酸钠液。取 70% ～ 80% 液体乳酸钠 16ml ，加水到 200ml 为 1M 乳酸钠液。 6 ． 染色应用液 NAD + 40mg ， 0.1M 磷酸盐缓冲液 4ml ， 氯化硝基四氮唑蓝 12ml ， 1M 乳酸钠 4ml ， 吩嗪二甲酯硫酸盐 1.2ml ， 混合即可。临用前配制，避光保存。 7 ． 洗脱剂 氯仿 9 份，无水乙醇 1 份，混匀。 8 ．固定液 10% 冰醋酸。 【操作】 1 ． 准备 将醋纤膜浸入 pH8.6 巴比妥缓冲液中浸泡 15 ～ 20min （注意：先让膜漂浮在液面，待膜全部湿润后在将膜浸入液内）。取出后用干滤纸吸去多余的水分。 2 ． 点样 将血清样本用小吸管吸出置于载玻片上，用点样器充分蘸满血清，然后将点样器垂直接触到膜一端 1.5cm 处，待血清全部渗入膜内，静置 2 ～ 5min （点样线应细窄均匀集中）。 3 ．电泳 点好血清的薄膜条放置于电泳槽滤纸桥上，糙面（点样面）朝下，点样端在阴极端，膜条与滤纸紧贴、拉直，然后盖上槽盖，平衡 5min 后即可通电。电压为 25V/cm ，通电 30 ～ 40min ，关闭电源，电泳完毕。 4 ． 染色 在电泳结束前 10min 配制染色应用液，取未用过的 2.5cm × 8cm 醋纤膜一条，使其漂浮在染色液上直到膜条完全湿透。将电泳毕的膜条自电泳槽内取出，点样面朝上贴于载玻片上。然后取出浸泡在染色液中的薄膜小心覆盖于载玻片的电泳膜上，切勿拖动，操作需迅速，避免起泡和干燥。将载玻片移置于有盖搪瓷盘内，盘内放一块湿润的纱布，以保持盘内湿度，置 37 ℃ 恒温水浴箱中，保温 40min （为节省时间可在 40 ℃ 温度下保温 5 ～ 10min ），在有 LDH 活性的地方即可显出紫色区带。 5 ． 定量 将染色后的膜条置于固定液中固定 10min ，待干后将各区带剪下溶于 2ml 洗脱液中，待膜溶解、色泽浸出以后用分光光度计在 560nm 波长处以洗脱液调 “ 0 ” ，求得各管吸光