抗体的制备课件2012.11.191（参考）.pptVIP

抗体的制备 林英 2012-11-19 一、单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb) 由识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体 称单克隆抗体， 是通过杂交瘤技术获得。 特点: ①高度均一性——抗原结合部位及同种型均相同; ②高度专一性——特异性高，少或无交叉反应; ③效价高稳定性好，可大量生产。 单克隆抗体的制备 二、多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb)用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。 多克隆抗体是针对不同抗原表位的抗体混合物，并非针对某一特定表位，其缺点是： 针对性不高； 易发生交叉反应； 也不易大量制备从而应用受限。 Ab1 Ab3 Ab4 单克隆抗体 抗原 Ab1 抗血清 Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Ab2 Ab3 Ab4 普通抗血清（多克隆抗体） 脾 B细胞 骨髓瘤小鼠取腹水 骨髓瘤细胞 HAT培养，稀释 单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图 杂交瘤细胞 + PEG, 融合 Ab2 多克隆抗体制备 1. 免疫动物：两只新西兰兔? 2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。? 3. 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。? 4. 免疫：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。? 5. 取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血或心脏取血，将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4℃，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。 时间（天） 制备步骤 说明 1 收到客户提供的抗原 开始制备多克隆抗体 2 SDS检测抗原 检测蛋白分子量大小、纯度和浓度 4 筛选一只新西兰大白兔 以免疫原包被ELISA板，筛选出1只血清本底较低的新西兰大白兔 6 第一次免疫 抗原+弗氏完全佐剂 22 第二次免疫 抗原+弗氏不完全佐剂 30 第三次免疫 抗原+弗氏不完全佐剂 38 采血ELISA检测 ELISA检测抗血清效价 1. 如果效价10,000， 可采血完成抗体制备 2. 如果效价10,000, 继续第四次免疫 45 第四次免疫 抗原+弗氏不完全佐剂 52 采血ELISA检测 ELISA检测抗血清效价 1. 如果效价10,000， 采血完成抗体制备 2. 如果效价10,000， 继续第五次免疫并告知客户 55 取少量血清（仅限北京客户） 北京客户可以收到少量抗血清进行预实验，检测抗体质量 60 采血制备抗血清 可获得30左右抗血清 65 最终提供 1-3ml免疫前血清 60-80ml抗血清 ELISA鉴定报告 多克隆抗体制备标准流程 免疫原的制备 免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系 统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最 重要的性质是免疫原性（immunogenicity）。 免疫原—天然抗原、人工或合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗 原性抗原和免疫佐剂～ 微生物抗原的制备： 标准菌株的选择：所用的菌种枯草芽孢杆菌（应具有典型形态菌落及生化反应）。在生理盐水中不发生自身凝集，与特异血清有高度凝集者可作为菌种。 菌液的制备 Ⅰ.原液制备： 原液的制备：将合格的枯草芽孢杆菌依上法培养后，用无菌0.5%石灰酸盐水将菌苔洗下或6000r/min离心收集菌落，洗液或收集菌落装入无菌试管置于37℃温箱中18—24小时杀菌得原液。或用置100℃水浴60分钟，破坏其H抗原即为O菌液。经检查无菌时可以使用。 Ⅱ.应用液的制备： 合格的原液用标准比浊管计算含菌落数目后，用生理盐水稀释至每毫升含菌10亿。为了应用液加入适量甲醛使其为0.25%，制备好的原液及应用液 均保存在2—10℃冰箱中备用，有效期为1年。菌液浓度的计算及稀释法：菌液的浓度可用麦克法伦特氏标准 比浊法来测定，方法如下：分别配制1%硫酸溶液及1%氯化钡溶液；取口径相等质地相同的试管10支，依下表所示分别将硫酸及氯化钡溶液加入，封固管口，注明号码备用。 将洗下的细菌原液放入与比浊管相同的试管中并予以一定稀释。与标准比浊管相比较，视其浊度相当于比浊管的第几管，然后将比浊管相当菌数乘以