抗原抗体的反应（参考）.ppt

发光免疫分析(luminescent immunoassay，LIR)也是近年发展起来的一项免疫分析新技术。用发光物质标记抗体或抗原。其反应原理与ELISA、RIA、FIA 等类似。根据发光物的来源不同，有化学发光(che’miluminessence)和生物发光(bioluminescence)不同方法。 一些化学发光剂如荧光醇(1uminol)，可用于标记抗原或抗体，反应时发光剂发生高能化学反应，形成处于电子激发态的分子，当这些产物分子回到基态时，伴随着光子的释放，发生化学发光现象。荧光醇在标记过程中易丢失发光能力，异荧光醇(iso1uminol)相对更稳定一些。一些发光分子的发光反应需要阳离子或酶的催化，还有一些化学发光分子如吖啶酯 (acridine ester)则不需催化剂的作用，只需在酸性条件下用过氧化氢诱导化学发光。目前把化学发光剂与发光增强剂结合使用，使光强度达到X光胶片曝光的要求。 生物发光常见的反应系统为虫荧素(luciferin)在虫荧酶(lucifase)的催化下，有ATP，Mg2+及O2存在．发生瞬时发光反应： 发光反应可用瞬时荧光仪检测记录，也可用胶片显影。 4．亲和标记的免疫分析 金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgG Fc段有高度的亲和力。用酶、同位素、荧光素等标记A蛋白，替代第二抗体直接与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。A蛋白对不同种动物来源的IgG 均有亲和性，可用于多数抗原抗体反应的分析，但有些动物的IgG 或少数亚类不与A蛋白结合，选择时应注意(见第三章)。生物素(biotin)是一种维生素，存在于多种生物组织中，也可以人工合成，能特异性地与来自卵蛋白的亲和素(avidin)或链霉菌的链亲合素(strepavidin)结合。生物素与亲和素有很高的亲和力，比抗原抗体结合的亲和力高104 倍，并且一个亲和素分子可与多个生物素分子结合。 全物素是小分子化合物(相对分子质量为224)，能通过双功能连接剂能与抗原、抗体、酶等大分子上氨基、羧基及糖基共价结合。—个大分子上可以标记数个生物素分子。链亲和素是相对分子质量为6．8×l04的大蛋白质，可用酶、荧光素等标记。标记后的生物素不影响其与亲和素的结合，因此在免疫分析中得到广泛的应用。一些不易制备抗体的生物大分子如核酸及多糖也常用亲和素—生物素复合物(avidinn—biotin complex，ABC)系统检测。如用生物素标记核酸探针，用于核酸杂交的分析。此外，小分子药物地高辛(digoxin)也可用于标记许多生物大分子，再用地高辛作半抗原免疫获得的相应抗体进行检测。用生物素、地高辛等小分子化台物标记技术，在分子生物学实验中得到广泛的应用，统称为非放射性标记分析技术。 三、免疫定位分析 1、免疫荧光定位分析 由于散射作用及生物材料所含天然荧光会影响荧光免疫分析(fluorescence immunoassay，FIA)的灵敏度和特异性。但不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学(immuno－cytochemistry)和免疫组织化学(immuno—histochemistry)检测，对某些有生物功能的分子在细胞或组织中的表达和定位仍是非常有效的方法之一。 常用的荧光色素(fluorochrome)为异硫氰荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC)和异硫氰四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，TRITC)等具有特殊的激发波长和发射波长(表7—5)。荧光色素用双功能交联剂标记至抗体的Fc 段不影响其与细胞和组织中的抗原特异性结合。组织切片或细胞样品处理既要使抗原结构保持完整并且充分暴露，同时也要保持细胞或组织结构的完整性。荧光色素可以标记特异性抗体，也可标记第二抗体，A蛋白或亲和素。还可用不同的荧光色素标记不同的抗体，同时进行两种以上抗原分子的定位。荧光通过荧光显微镜来观察，组织切片和细胞上的荧光暴露在紫外光下，会迅速衰弱成淬灭，因此观察时要迅速，用荧光分析电脑软件进行记录分析可以得到更为准确而清晰的纳果。 用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+和CD8+T细胞亚群，在临床上具有重要意义。用荧光抗体标记的不同淋巴细胞亚群，根据荧光强度及种类的差异用流式细胞仪可将不同细胞群分离，称为荧光激活细胞分拣器(fluorescence－activated cell sorter，FACS)(图7—20)。用两种特异性荧光抗体(抗CD4 和抗CD8)标记淋巴细胞，则有4 种不同标记强度的细胞。细胞通过FACS 的喷嘴形成微滴，一个细胞形成一个微滴，当其通过激发光束时，产生的荧光信号被检测到，在记录的同时，将信号反馈至下方电极板，电极板根据荧光的强度和种类使微滴发生偏