药物分析第八章课件.pptVIP

第一节 无菌检查 无菌技术指在整个微生物检验过程中，控制微生物污染的一系列操作方法和措施 。 5、试验前的准备 1. 开启紫光灯和空气过滤装置，至少 30min。检查环境洁净度10000级下的局部 洁净度100级的单向流空气区域进行。 2. 人员穿戴无菌服，进入无菌操作室。 4. 操作前 乙醇棉球消毒→启封→检查瓶盖、瓶口有 无生霉、长螨 366nm紫外线下观察 验证：计数方法的验证 ??????当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细 菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用 的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测 定。 若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检 验结果时，计数方法应重新验证。 ? 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母 菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌 的回收率应逐一进行验证。 ?????? 菌种???验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代 （从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代） ，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的 生物学特性。 ? 验证方法???验证试验至少应进行3次独立的平行试 验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。??验 证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同 时进行。 包括平皿法和薄膜过滤法。 （一）细菌、霉菌及酵母菌计数 目的：检测药物在单位质量或体积内所存在 的活菌数量，常用平皿法。 验证：验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收 率。 （1）试验组?? 平皿法计数时，取试验可能用 的最低稀释级供试液1ml 和50~100cfu试 验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿 法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定 量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤， 冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50~100 cfu试验菌，过虑，按薄膜过滤法测定其菌 数。 （2）菌液组?? ? 测定所加的试验菌数。 （3）供试品对照组 ??取规定量供试液，按菌落 计数方法测定供试品本底菌数。 （4）稀释剂对照组?? ?若供试液制备需要分散、乳 化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加 稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受 影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试 品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含 50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落 计数方法测定其菌数。 结果判断???在3次独立的平行试验中，稀释剂对照 组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液 组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若 试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试 品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数 的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法 和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若 任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采 用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、 中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑 菌活性，并重新进行方法验证。 操作要点： 1.一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多 个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌 落数，实际为菌落形成单位数（ cfu） 2.供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。 3.培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法 的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。 4.作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。 5.细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落 极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落 数。 6.含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培 养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养 基测定酵菌数，并且合并计数。 7.若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。 8.使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任 何容器或用具。 9.供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试 液，以免造成实验误差。 10.培养基的分装量不得超过容器的2/3以免灭菌时 溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成 染菌。 11.培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。 12.灭菌后的培养基应保存在2-25℃ 防止被污染， 可在三周内用毕。 13.已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再 用，更不要反复加热溶化 。 14.注皿时培养基应在45±1℃，高于45℃时易造 成细菌受损或致死，低于45℃时易凝固，影响混 匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。 15.倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到 皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。 16.采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少 量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤