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蛋白免疫印迹流程 2016.09.25 注意事项： 蛋白印记实验的步骤及需要注意的细节繁多、耗时长，稍有懈怠或疏漏都会导致实验结果的不佳或失败，因此要特别的认真仔细，心细如丝，并保持这一状态至最后，这也是恒心、韧劲、精力集中的良好训练。细节决定成败！ 蛋白印记实验的目的是获得充分分离的、充分转膜的、均匀干净的（sharp）目的蛋白条带，能充分反映实际蛋白水平并可进行后续统计学分析的显色成像结果。所有的实验细节都是围绕这个中心目的进行的。 试剂：试剂质量达标、称量准确；缓冲液PH值正确、保质。 玻璃板装载：玻璃板及支架干净、无异物；装载严密（不漏胶、漏液）。 制胶：胶板成分比例准确、浓度适当、均匀、干净（无异物、无气泡）。 样品准备：量取精确、变性充分、无沉淀。 上样：无溢出、样本溶液均匀分布、胶板无裂隙。 电泳：低温；电流通畅（上层电泳缓冲液充分）；电压、电流相匹配。 转膜：胶、膜标记准确；转膜单位之间无气泡；胶、膜、滤纸大小一致；低温；电压、电流相匹配。 切膜：分子量准确；标记准确；湿润（不干燥）。 封闭：脱脂奶粉溶解充分；孵育温度、时间适当。 一抗、二抗：质量无疑问；浓度适当；孵育温度、时间适当。 洗膜：摇速、时间适当。 显色：淋干；显色液充分接触、无流失。 膜：以上操作要求PVDF膜完整无损伤，不碰触、刮擦、冲刷样本蛋白面。 一、分离胶和浓缩胶的制备 装载玻璃板 彻底擦净玻璃板和支架，仔细检查，确保无异物，将玻璃板固定在支架上。 备注：① 玻璃板内外面要彻底用酒精擦干净，特别是内面，确保无杂质异物及脂质、手印等，如有上述异物杂质，就易出现胶中有斑点、蛋白条带扭曲、转膜效率下降、PVDF膜不干净等现象。 ② 玻璃板之间之间要严密接触，无异物，如有异物（如有胶块干固在上面），则易造成上紧旋钮时，异物致使玻璃板碎裂，如没有碎裂，就会出现漏胶的现象，使胶凝固不均匀（蛋白条带扭曲），胶面下降，有效分离胶距缩短，蛋白条带分离不充分的现象。 ③ 玻璃板与装置之间要严密接触，无异物，如有异物（如有胶块干固在上面），则易造成上紧旋钮时，异物致使玻璃板碎裂，如没有碎裂，就会出现在电泳时漏电泳缓冲液的现象，使电泳效果不佳，并需频频补充上层的电泳缓冲液。 ④ 上紧螺扭时，要4个旋钮均匀同时逐渐上紧，如先上紧1个，再上紧其他的，易出现各点松紧不一、错位，导致漏胶或漏电泳缓冲液的现象。 配置分离胶： 依照目的蛋白分子大小③ 胶面一定要与内侧短玻璃板上沿相距1.5-2 cm，宁长勿短，过短会导致浓缩胶胶距减少，蛋白样本不能被有效的浓缩。 （2）上层注满干净的蒸馏水封胶，等待胶聚合凝固。 备注：① 加水封胶的目的是压平分离胶面，如没有压平，胶面会坑洼不齐，造成蛋白条带的参差不齐。另外，水封还可防止胶和空气接触氧化。 ② 加水封胶时，要轻慢，并沿长玻璃板的内壁往复移动加注，使水均匀分布在分离胶上。如仅在一点快速灌注，易使胶浓度及形状发生改变，影响胶的均一性和蛋白条带的水平性，因分离胶本身也是含有大量水的，加水过快和不均匀，会稀释上层的分离胶并造成胶的浓度不均。 ③ 夏天胶凝固的时间约30 min，夏天室温较高，凝固较快，冬天室温较低，凝固较慢，要适当延长凝胶时间。可通过观察凝胶面的形成（水和胶之间有一条折射线）判断凝胶是否充分。如果凝固时间过长，并且凝固不充分，要考虑制胶的个个组成成分是否存在问题，特别要考虑到TEMED和10% AP这两个试剂是否失效。 ④ 注满蒸馏水有利于观察是否有漏胶。如在分离胶凝固的过程中，蒸馏水的液面有稍微的下降（水蒸发所至），说明没有漏胶。如蒸馏水的液面有大幅下降，则说明出现了漏胶。如漏胶严重，则需重新制作分离胶。 （3）待分离胶聚合完全，倾倒出上层蒸馏水，用滤纸吸干多余的水分。 备注：① 滤纸切勿触及分离胶，造成胶面不平整，导致蛋白条带扭曲的现象。 ② 先将玻璃板以一定角度（45度角）倾斜倒扣在桌面上1-2 min，使蒸馏水沿分离胶的斜面集中流向一侧。然后用折叠的双层滤纸插入玻璃板间隙吸干剩余的蒸馏水。要事先弹打滤纸，以去除其上面粘附的碎屑，避免将碎屑带入玻璃板间。 配制浓缩胶： 依照胶板的数量，厚度和长度，配制适当体积的分离胶。（详见表附2） 备注：注意事项同分离胶配置。此步骤的要点是，浓缩胶比分离胶凝固快，操作要稳健迅速，在加入TEMED和10% AP后，迅速混匀并加入到玻璃板内。 灌注浓缩胶及插梳子： 用1 ml加样枪将混匀的浓缩胶迅速灌注于分离胶上至内侧小玻璃板夹层上沿，立即插入梳子，在室温下聚合。 备注：① 用枪吸净浓缩胶表面的气泡，并将浓缩胶灌满至溢出为止，这样插 梳子时不易产生气泡。 ② 梳子要提前彻底擦净、晾干，不能有杂质附着在梳子上。 ③ 插梳子时，注意梳子的反正面，将平面对着长