果蝇总RNA的提取.docVIP

果蝇总RNA和总蛋白的提取与电泳条带分析摘 要：本实验第一部分用果蝇成体为材料，以Trizol为提取液提取total RNA，进行反转录制备cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测total RNA和cDNA浓度，并结合电泳图谱对total RNA和cDNA图样进行分析；第二部分以果蝇幼体为材料，提取总蛋白，通过SDS检测果蝇总蛋白表达，对表达结果进行简要分析，并比较了成体和幼体果蝇的蛋白表达差异。关键词：果蝇；total RNA；总蛋白；反转录；RT-PCR1 前言果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名：Drosophila melanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代[1]，之后的二十年中，一系列的科学发现补充了中心法则的各个环节，由此进入现代分子生物学发展阶段，基因工程技术也应运而生。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。本实验的方法及步骤若应用到基因工程中则可划分到目的基因的获取这一环节。即根据中心法则，DNA上的遗传信息经转录传递到mRNA，而mRNA含量较少，可通过提取总RNA的方法获得mRNA，再经特定引物的反转录获得cDNA，进而得到目的基因从而应用到分子及发育生物学研究中去。同时，对RNA和总蛋白的电泳分析也是在转录水平和翻译水平研究基因表达的重要方法，即在基因工程运用中可用于检测目的基因是否导入受体细胞及是否能够顺利表达，常用的方法有Northern lot、RNA原位杂交、Western lot等。2 材料与方法2.1 实验材料黑腹果蝇成虫2-3d龄，约6只，雌雄均等2.2 试剂及仪器（1）试剂：Trizol裂解液（50mg/ml），氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNase free H2O，琼脂糖，TAE电泳缓冲液，DNA marker，dd H2O，10×PCR uffer （含Mg2+），dNTP（10 mM each），引物：rp49F、rp49R；CG8189F、CG8189R， Taq DNA polymerase（2U/μl），TS缓冲液（20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl, pH7.9），蛋白上样缓冲液，染色液，脱色液[2]。（2）器材：1.5ml离心管，匀浆棒，高速台式离心机，200μl及1ml微量移液器及吸头，天平，量筒，锥形瓶，微波炉，制胶板，电泳槽，电泳仪，凝胶成像仪，PCR仪，水平摇床等。2.3 实验方法2.3.1 果蝇total RNA的提取、反转录及RT-PCR取果蝇成体于1.5ml离心管中，加1ml Trizol（50mg/ml）裂解液后，用匀浆棒匀浆，室温放置5min，使其充分裂解，之后，在4℃条件下12000g离心5min。转移上清至一新离心管中，加入氯仿（200μl氯仿/ml Trizol），振荡混匀，室温放置2min。在4℃条件下，12000g离心15min。取出离心管，小心转移上层水相至新离心管中。加入异丙醇（0.5ml异丙醇/ml Trizol），充分缓慢混匀，室温放置5min。在4℃条件下12000g，离心10min。取出离心管，弃上清，加入1ml 75%乙醇，悬起管底沉淀，继续在4℃条件下，7500g离心5min。取出离心管，弃上清，室温干燥RNA沉淀。加入50μl RNase free H2O溶解，备用。以RNA为模板，利用Promega公司提供反转录试剂盒合成了第一链cDNA；（1）取一只DEPC处理过的小EP离心管，向其中加入以下混合液，其体系如下： Total RNA 1 μl RNase-free H2O 4 μl Oligo-anchor R 1 μl（2）将混合液充分混匀并瞬时离心，置于70 ?C孵育10 min后，立马在冰上冷却2 min，再次瞬时离心使得混合液集于管底；（3）冰上继续向管中加入 : 5×Reaction uf