医学分子生物学思考题.doc

1.什么是基因工程？它包括哪几个主要步骤？ 基因工程（gene engineering） ：将不同生物体的核酸分子在体外经过酶切、连接，构建成重组的核酸分子 ，再把它导入受体细胞内 ，使外源基因在受体细胞中表达。 基因工程研究应包括以下 6个主要内容或步骤： 1）获取基因：从复杂的生物有机体基因中，经过酶切消化或PCR扩增等方法，分离出带有目的基因的DNA片段。 2）克隆载体构建：在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制，并带有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子－－克隆载体。 3）克隆载体转化：将克隆载体转入受体细胞，并与之一起增殖。4）克隆载体筛选：从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了克隆载体的受体细胞克隆。5）克隆载体鉴定：从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已经得到扩增的目的基因，并做酶切、序列分析等鉴定。 6）表达载体构建和表达：将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使 之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。把以上6个步骤称作是基因工程(上游研究)。 2.什么是限制性核酸内切酶？举例说明。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）简称为限制性内切酶或限制酶 。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割双链DNA的酶。Bam HⅠ、Eco RⅠ、Hind Ⅲ、NotⅠ、Pst Ⅰ、SmaⅠ 3.什么是质粒？理想的质粒载体应具备什么条件？ [质粒]（plasmid）染色体外，能独立复制，能稳定遗传的一种环状双链DNA分子。理想质粒载体所必需具备的条件:1.质粒较小（3—5Kb) 小质粒通常拷贝数较多， 外源DNA容量较大, 容易转化，容易分离，不易断裂，容易鉴定2.带选择标记,对抗菌素的抗性，Amp, Tet, Kana, Neo ,α互补3. 有单一限制性酶切位点 (多克隆位点 MCS ）单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入。多个不同的单一限制性酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。4.具有复制起始点（Ori) 质粒DNA增殖所必不可少的结构。5.作为原核表达载体:还要有启动子，核糖体结合位点（SD）和终止子序列。6.真核表达载体:还要有① 真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A 加尾信号等② 真核细胞复制起始序列③ 真核细胞药物抗性基因 4.组织工程的三个重要组成部分以及它们的作用是什么？ 细胞、生物材料和环境；细胞用以修复组织器官；生物材料为细胞提供支架供其生长；环境的作用是为细胞的生长提供必须的物质和必备的条件。三者作为一个整体构建组织、器官或其生物性替代物, , 以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能。 5.种子细胞类型及其各自的优缺点？ 种子细胞（Stem cell）分：组织来源的细胞和胚胎干细胞，组织来源的细胞优点：构建出的组织在形态、结构和功能上与正常组织比较接近，缺点： 体外培养易老化、不易扩增 ，会造成供区部 位的组织缺损和功能障碍；胚胎干细胞优点：全能性，缺点：安全性、伦理性。 6.举例说明组织工程技术可用于那些组织修复（要求简述构建过程）？ 从理论上说可以用于修复所有组织，但从技术方面考虑，有些组织的培养还存在问题，现在主要用于修复皮肤、肌腱等组织。首先，取活体肌腱组织，制备成肌腱细胞培养皿，加入生长因子促进其分裂增殖，在培养时需烤炉低氧因素将，并且在切割后的硅胶培养皿中高密度培养,获得半成品后可以在体内外继续生长，注意周期性拉力因素，最后以手术方式将成品移植到机体身上，并继续观察。 7.试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件，及影响外源基因表达的因素。 外源基因具备的条件：编码区不含插入序列； （mRNA-cDNA ） 位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；含起始密码子、终止密码子；转录出的mRNA 必须有SD 序列 ， 调整SD 序列与第一个AUG 间的距离（因为会对转译效率有影响）；产物比较稳定（如：融合蛋白、信号肽）；选择系统偏好的简并密码。影响外源基因表达的因素：启动子的强弱 （主要因素）基因的剂量，RNA 转译效率 （SD 互补、AUG-SD 距离及序列、AUG 前后核苷酸序列的适宜性）密码子、表达产物的大小、产物的稳定性。 8.蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类，请列举其中的一类，谈谈它的原理及应用。 利用溶解度差别的分离方法、利用分子大小不同的分离纯化方法、 根据蛋白质分子带电性质不同的分离方法、根据蛋白质吸附性质不同的分离方法、；利用蛋白质的特异性配体分离方法—亲和层析，利用一些生物大分子可以和相应的物质特异而可逆的结合，如抗原和抗体、激素和受体、酶和抑制剂、酶和底物等，应用是将要分离的物