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PCR原理 反应体系： 含有目的基因或序列的DNA模板 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg2+等 反应过程 变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开； 退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合； 延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。 循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍 基因敲除 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到敲除特定靶基因的目的。 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。 选择筛选已击中的细胞：基因转移的同源重组自然发生率极低，目前常用的方法如正负筛选法以及PCR法。 表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。 得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传 RNA干扰 利用了由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。 RNA干扰包括起始阶段和效应阶段： 在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 绿色荧光蛋白的三种应用 报告基因 将荧光蛋白基因置于一个感兴趣的目的基因调控之下，通过对荧光信号强度的记录，可以检测目的基因在组织或活细胞中的表达状况。 融合蛋白标签 通过常规克隆技术，可以构建由荧光蛋白和目的蛋白组成的融合蛋白，融合蛋白的表达使得研究者可以监测靶蛋白的定位，并对细胞生命活动进行动态可视化观察。GFP融合蛋白标签被认为是GFP在生物技术最为成功和广泛的应用。 荧光能量共振转移 FRET是一个荧光供体分子在被激发后，将能量以非辐射的交换方式传递给10-100 ?范围内的受体分子。FRET现象的发生要求荧光供体分子的放射光谱和受体分子的激发光谱是部分重叠的。 原核生物复制相关酶和蛋白及其功能 一、DNA聚合酶 种类： ①DNA聚合酶I： 由一条单一肽链组成，是一个多功能酶，包括： DNA聚合酶活性 3′-5′外切核酸酶活性，被认为起着校对的功能，能切除聚合过程中的错配碱基 5′-3′外切核酸酶活性 ②DNA聚合酶II：没有5′-3′核酸外切酶活性， 次要的DNA修复酶 ③DNA聚合酶III：是真正的DNA复制酶（多亚基、多层次组装） ④DNA聚合酶IV ⑤DNA聚合酶V（以上两种酶参与SOS修复） 二、解螺旋酶 解螺旋酶利用水解NTP产生的能量在复制叉处打断氢键，使亲代DNA双链分离。 三、旋转酶 通过水解ATP引入负超螺旋，消除复制叉前进带来的扭曲张力 四、SSB蛋白（单链结合蛋白） SSB蛋白与单链结合： 防止单链复性 维持单链刚性状态