由多糖纳米粒运载的survivinsiRNA的小鼠体内抗肿瘤作用.docVIP

由多糖纳米粒运载的survivin siRNA 的小鼠体内抗肿瘤作用 关键词：凋亡抑制基因 siRNA(小干扰RNA) 非病毒载体 纳米粒 抗肿瘤治疗 摘要: 最近由于其在抑制肿瘤细胞凋亡过程中起着重要作用，凋亡抑制基因已经引起广泛关注。通过siRNA下调凋亡抑制基因的表达为抗肿瘤治疗提供了一个可行途径，然而，缺少合适的siRNA载体明显阻碍了survivin siRNA 在抗肿瘤治疗中的应用。本研究的目的是我们利用多糖载体TAT-g-CS运载功能性siRNA并且评价其在体内的抗肿瘤活性。首先合成TAT-g-CS载体并且结构表征良好。MTT结果显示TAT-g-CS载体存在良好的生物相容性。含有siRNA的TAT-g-CS纳米颗粒平均粒径为212.2 nm，多分散性指数为0.121，纳米粒子的Zeta电位为+18.58 mV。从报告基因检测结果表明，当由TAT-g-CS运载时，荧光素酶基因靶向siRNA可减少75.3%荧光素酶基因的表达。最关键的是，我们使用靶向survivin基因评估TAT-g-CS体内外输送能力及抗肿瘤作用。我们的研究结果表明，TAT-g-CS / 纳米粒子不仅通过诱导细胞凋亡可强烈抑制4T1-luc肿瘤细胞的体外增殖能力-，而且有效地抑制体内的生长和恶性乳腺肿瘤的转移，这表明TAT-g-CS / 纳米粒是一种高效的siRNA非病毒运载系统，尤其是基于siRNA的抗肿瘤治疗。 简介 恶性肿瘤，即癌症，是严重威胁人类的健康致命疾病。统计报道称，世界上每年大约有八百万人死于各种癌症，包括乳腺癌，肺癌，肝癌，脑瘤等。因此，人们已付出巨大努力来探寻有效抗肿瘤的治疗方法。最近，Survivin已因发现其在大多数恶性肿瘤中过度表达但在正常组织中表达程度很低而引起人们广泛的关注。结果表明，Survivin是细胞凋亡的抑制剂家族（IAP）的成员，并且Survivin的表达在肿瘤细胞中上调，作为一个整体， Survivin在抑制肿瘤细胞的凋亡过程的过程中，起着非常重要的作用，。因此，Survivin已证实是癌症治疗中很有前景的药物靶标。目前，下调Survivin基因的表达成为癌症的一种有效的治疗方法。 小干扰RNA是一种长度为20到25个碱基的双链RNA。通过诱导RNA干扰反应，siRNA能特异性下调靶基因的表达，这为严重疾病尤其是各种癌症，提供了有发展前景的治疗方式。 最近，已设计出survivin靶向siRNA并应用其抑制survivin基因，从而抑制肿瘤生长。当单独使用裸露siRNA时，细胞内吸收极差，且易被核酸酶分解，所以需要载体保护运载siRNA进入细胞发挥治疗作用。到目前为止，缺乏适当运载体已成为用siRNA 疗法治疗癌症等严重疾病的一个主要障碍。虽然病毒载体转染率高，但因其具有潜在的致病性和免疫原性，及制备困难，导致其运用受到严格限制。相反，非病毒载体因其具有的制备简单，高生物相容性，非致病性和非免疫原性而引起高度重视。 众所周知，壳聚糖已被用作非病毒载体来运载质粒DNA和siRNA。与此同时，很多壳聚糖衍生物也被研究用来运载siRNA.最近有报道称，TAT肽，一种性能优越的细胞穿透肽，被共轭到壳聚糖纳米粒表面用来运载siRNA。在这项报告中，TAT表面改性的壳聚糖纳米粒递送力研究FMC生物高分子碳化二亚胺盐酸（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐胰蛋白酶，胎牛血清DMEM和1640培养液来自Dojindo公司。碘化丙啶（PI）生物技术研究所（海门碧云天，中国）。荧光素酶报告基因检测系统试剂盒自promega。膜联蛋白vefitc凋亡检测试剂盒凯基生物科学公司。其他化学品和试剂分析级2.2肽和siRNA的合成 氨基酸序列GCGGGYGRKKRRQRRR的TAT肽由吉尔生化有限公司和由Dharmacon公司合成。、分别靶向荧光素酶基因和survivin基因。 5‘-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3‘ 5‘-GAACAUCAUCAUCCAGGAC-3‘ . 2.3 tat-g-cs的合成及结构表征 EDC和NHS作为偶联试剂溶液透析去离子水48小时通过冻干透析溶液反应得到Nicolet5700FTIR热检测器在分辨度为600-4000范围内检测。核磁共振氢谱检测条件是室温、弛豫时间2秒、重水为溶剂Bruker mercury-500兆赫光谱仪（瓦里安）人乳腺癌细胞系MCF-7-Luc小鼠乳腺肿瘤4T1-Luc由中国协和医科大学医药技术研究所提供。这些细胞株标记荧光素酶报告基因，并能稳定表达萤火虫荧光素酶。mcf-7-luc细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基CO2的潮湿环境下培养。类似的4T1-Luc细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培