2015-2016生物药物分离纯化技术实验指导.docVIP

实验一 蔗糖密度梯度离心分离实验 实验目的 熟悉蔗糖密度梯度离心原理 熟练掌握蔗糖密度梯度离心操作技术 实验原理 溶液的密度自上而下逐渐变化的分布状态称为密度梯度。在超速离心技术中，样品的密度应该分布在溶液的密度梯度范围内。 材料、试剂及仪器 试剂 20%、40%、60%、80%的蔗糖溶液；墨汁。 2.仪器 烧杯，普通离心机，试管若干。 四、实验步骤 梯度液的制备 制备出不同浓度的蔗糖溶液，浓度间隔相同，分别是浓度为20%、40%、60%、80%的蔗糖溶液。 每个浓度量取相同的体积，按浓度依次减小的顺序逐个缓慢铺入离心管中，制成不连续阶梯密度梯度。 此离心管在20-25℃静止2-3h，通过重力作用即成接近线性的蔗糖密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5-1h。温度低时所需静置的时间较长，温度高的时候则较短。为减少对流，静置后应将离心管置于冰浴中备用。 蔗糖密度梯度离心 向已形成密度梯度的离心管中加入半滴墨汁，加入离心管中离心，3000r/min离心10min，观察实验现象。 五、结果与分析 蔗糖密度梯度离心和差速离心有什么区别？ 实验二 双水相相图的制备 实验目的 1.了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势 2.掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法 实验原理 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。 双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。 连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ 材料、试剂及仪器 1.试剂 PEG400；硫酸铵。 2.仪器 漩涡振荡器、微量滴管装置 、电子天平。 四、实验步骤 1.双水相系统的制作 （1）精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。 （2）精确称取PEG400液体0.7g于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。 （3）按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。 序号 加水量 （ml） 加(NH4)2SO4溶液量（ml） 纯(NH4)2SO4新增量（g） 纯(NH4)2SO4累积量（g） 溶液累计总量（ml） PEG400重量百分比 (NH4)2SO4重量百分比 1 2 3 4 5 6 7 2.相图的绘制 以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。 五、注意事项 1.微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉，可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。 2.清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。 3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。 4.滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。 六、思考问题 1 双水相萃取中相图有何意义？ 2 双水相萃取在分离生物大分子物质时有何意义？ 实验三 牛血清蛋白在双水相萃取系统中的分配 实验目的 1.了解双水相萃取的原理和方法 2.双水相系统分离蛋白质的操作 实验原理 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合