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实验2.ppt
细胞实验(二)细胞损伤与保护2 设3组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复 用不同的实验方法检测、验证实验结果 实验内容 细胞电子显微镜检测 细胞活率测定 亚细胞结构的分离与鉴定 实验设计 1. (电镜)每班传细胞入含小盖片培养瓶6瓶( 2组) 2瓶正常、4瓶损伤、第二天2瓶损伤后恢复 2. (活率)每组传细胞入96孔培养板9孔 3孔正常、6孔损伤、第二天3孔损伤后恢复 3. (分离)每班传代细胞8瓶 4瓶细胞1传2至25ml培养瓶成8瓶细胞 细胞电子显微镜检测 细胞电镜标本制备 原 理 光学显微镜无法看清小于0.2um的细微结构,我们把这些细微结构称为亚显微结构(submicroscopic structures)或超微结构(ultramicroscopic structures;ultrastructures)。要看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。 电子显微镜与光学显微镜 的结构,从原理上来说是相似 的,但也有不同之处。 首先不同的是用电子束(电子流)代替照明光源。 其次,电镜使用的是电子透镜,而不是光学透镜,电子透镜不是肉眼可见的物质透镜,它是由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起到透镜的作用。 第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标本中不同结构中原子与电子发生碰撞后,造成电子散射角度不同,使荧光屏上的电子强度也相应不同。 电镜制样技术 由于电子束的穿透能力有限,为了获得较高分辨率,需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为40~50nm的超薄切片。这就需要样品有一定的刚性和韧性,为此,样品需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构,因此超薄切片样品制备的第一步就是固定,其后依次是包埋、切片和染色。 超薄切片的制备 1、固定:戊二醛和(OsO4)等, 锇酸后固定。 2、包埋:环氧树脂和丙烯酸树脂等。 3、切片:玻璃刀用超薄切片机切片, 厚度40~50nm,切片收集在 铜网或镍网上,在电镜下观察。 4、染色:常用的染色液是醋酸双氧铀(易 染核 酸)和铅盐(易染蛋白质)。 结 果 在电子显微镜下观察 比对正常、损伤及损伤后恢复标本 照相 分析 总结 要 求 送标本 照片结果分析 细胞活率测定 MTT比色法 原 理 四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受H原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶,能使外源性淡黄色的 (MTT)还原成难溶于水的结晶,并沉淀在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪,在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。 器材与试剂 器材:培养细胞(96孔细胞培养板) 酶标仪、移液抢、抢头等 试剂:5mg/ml MTT溶液 二甲亚砜(DMSO)溶液 DMEM培养液(高糖、无糖) 实验步骤 1、接种1.5×104/ml细胞于96孔板:每组9孔 2、每孔加200ul培养液:3孔正常(高糖)、 3孔损伤(无糖)、3孔损伤恢复(无糖 有糖 ),37oC、5%CO2、饱和湿度下培养; 3、测定前2h,每孔吸弃原培养液,加高糖培养 液180ul 、再加 MTT溶液20ul,继续培养; 4、到2h测定时,每孔吸弃培养液, 加DMSO 溶液150ul,振荡5分钟; 5、酶标仪492nm波长处比色。 结 果 记录酶标仪上光吸收值 分析每组细胞生长情况 注意事项 每孔的细胞密度不能超出1x105 /ml , 避免影响实验的区分度; 高浓度血清会导致实验本底增高, 比色前尽量使血清浓度不超过10%。 亚细胞结构的分离与鉴定 细胞核的提取 原 理 细胞内各种细胞器质量不同,在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理,常用差速离心法、密度梯度离心法来分离各种细胞器。 分离的各种细胞器可以用组化等方法加以鉴定。 本实验利用此原理仅对细胞核进行分离、鉴定,其上清液可作进一步分离。 器材与试剂 细胞株CHL 离心机、天平、离心管、显微镜、 染色缸、滴管等 消化液、0.075M KCl、0.25%蔗糖溶液、 甲醇固定液、Giemsa染液 操 作 收集细胞(消化法 )—— 离心(100
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