分子生物学实验指导_LSW教材分析.docVIP

实验一 质粒DNA的小量制备 （碱裂解法） 实验原理 所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。 本实验以碱性SDS快速小量制备pC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯溴化乙锭梯度平衡。 环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（cDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（L DNA），通称L构型。质粒DNA Mr一般在106～107之间，常以kb表示（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pC19的Mr为1.8×106 (2.69 kb)。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管Mr相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为L DNA和ocDNA。 实验材料与设备 用品与仪器 可调微量取样器（20 μl、l 000 μl），，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速微量离心机，旋涡振荡器。 含pC19质粒DNA的大肠杆菌。 试剂 LB（Lria-Bertani）培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.0高灭菌。 溶液I：50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris·HCl（pH8.0）10 mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌(6895×104Pa) 15min，贮存于4℃。 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH1％SDS（临用时配制）。 溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60m 5mol/L KAC，11.5m冰醋酸，28.5m H2O）钾离子浓度为3 mol/L，醋酸根离子浓度为5 mol/L。灭菌。 V（酚）：V（氯仿）=1∶1：酚需在180℃重蒸，加入抗氧化剂8–羟基喹啉，终浓度为0.1﹪，并用Tris·HC缓冲液平衡至pH＞7.6。氯仿中加入异戊醇［V（氯仿）∶V（异戊醇）=24∶1］。 1×TE/RNaseA：10 mmol/L Tris·HC，pH8.01mmol/L EDTA；20μg/ml RNaseA。 无水乙醇，70％乙醇，氨苄青霉素贮存液50 mg/ml。 实验操作程序 细菌的生长与收获 （1）将3~5 ml含氨苄青霉素（50 μg/ml）的LB加入到容量为15 ml、通气良好的长玻璃试管中，接入一单菌落，于37℃振荡（350 r/min）培养过夜。 （2）取1.5 m细菌培养物加入Eppendorf管中，以5 000 r/min离心2 min去掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。 碱裂解法 将细菌沉淀重悬于100 μl预冷的溶液Ⅰ中，充分分散混悬细菌。 加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒数次，充分混合，要确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触，冰浴放置5min。 加入150 μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，冰浴放置5min。 在4℃以10 000 r/min离心5min，转移上清液到另一个Eppendorf管中。 向上溶液加入等体积/酚/氯仿，振荡混匀，以5 000r/min离心2 min，转移上层水相至新的Eppendorf管中。 向水溶液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置5 min，以10 000 r/min离心5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。 加入1 ml 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，按步骤（6）所述方法弃上清，于空气中或用电吹冷风使质粒DNA沉淀干燥。 用20~30 μl含RNaseA酶（20 μg/ml）的TE溶解沉淀，4℃贮存。 琼脂糖凝胶电泳鉴定 质粒DNA通过琼脂糖凝胶电泳方法可鉴定。通常情况下经碱裂解制备的质粒DNA电泳时可见2~3条带。 讨论 1．细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。通常