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第三章 临床免疫学检验 参考书：本次培训班教材，临床酶免疫测定技术（李金明编著，人民军医出版社） 教学方式：示教、操作、提问、讲解等。 总学时：90-100min 检验流程及相关重点知识 分析前 （一）酶免实验室需要的基本配置 酶标仪使用的注意事项 （1） 测定波长，根据标记用酶和底物选择相应的波长 （2）测定的吸光度范围，0~2.5之间基本能满足ELISA的测定要求，主要看在一定的吸光 度范围内的线性和精密度如何。 （3）光学系统，通常采用的是垂直光路多通道（8或12通道，亦有单通道）检测，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道。光学系统功能可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。其中测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。 （4） 检测速度，检测速度快有利于提高检测的精密度。 （5） 震板功能 （6） 软件功能：定性试验的cutoff及其测定灰区的统计计算功能；定量试验的剂量反应曲线的拟合；以及实验室LIS系统数据传输等 2、洗板机使用的注意事项： （1） 最小残留量是衡量洗板机洗板效果最重要和最直观的参数 （2）洗板机最好具有底部冲洗、两点洗液等功能的仪器。底部冲洗有利于减小微孔板底部的干扰性吸附，两点吸液可大大降低微孔液体残留量。 （3） 每日使用完毕后应用1%次氯酸钠冲洗管路和洗板头，然后用双蒸水冲洗管路。 3、加样枪使用的注意事项 （1） 具体操作：设定容量值，吸液，放液 （2） 预洗：当装上一个新吸头或改变吸取的容量值时应预洗吸头，先吸入一次液样并将之排回原容器中，提高移液的精确度和重现性。 全自动酶免分析仪的简单介绍 （1）全自动酶免分析仪集加样，温育，洗板，比色于一体，使用注意事项： 1）做好标本的前处理； 2）准备好微孔反应板； 3）注意报警信息； 4）搞好日常维护与保养； （二）标本的采集、验收及保存 1、标本的采集与送检（参考《临床检验操作规程》）： 2、可能影响测定结果的标本因素 （1） 外源性干扰因素 1）标本溶血：标本采集时应注意避免严重溶血，因血红蛋白中含有血红素基团，有类似过氧化物的活性。 2）标本凝固不全：若血液没有完全凝固，纤维蛋白块或残留血细胞易造成假阳性，建议尽量不要用抗凝血，尤其是肝素钠抗凝剂。 3）标本贮存时间过长：标本保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本地过深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。 4）ELISA的灵敏度1ng/ml水平上，标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本，如果用同一管血应先做免疫后做生化。 （2）内源性干扰因素及处理 1) RF：稀释样本；改变酶标抗体，将酶标抗体的Fc片段酶切去除。 2) 补体：加热灭活 3) 高浓度的非特异免疫球蛋白：稀释样本 4) 异嗜性抗体：使用特异的兔F(ab’)2片段作为固相或测定酶标抗体 (三)试剂的选择和准备 1、选择优质试剂，试剂质量在很大程度上决定了检测水平，应选择灵敏度高，特异性好，精密度（CV）好（批内CV 值小于15 %），稳定性和安全性好，且简便经济的试剂。 2、不同批次的试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件，严格执行这一标准可以避免试剂批号改变而重建质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性，另不同批号试剂盒中组分不得混用。 3、平衡室温：从4℃冰箱取出的试剂必须放置室温20～30 min 后再启用，一是防止水化层的形成可能影响试剂的原始浓度及试剂中溶质分子的均匀分布。二、保证在温育反应中，能使反应微孔内的温度较快达到所要求的温度，满足实验要求。 4、未用完的试剂和质控品应密封并及时放回冰箱保存，蛋白质在冷冻过程中会出现蛋白分子分布改变，试剂正式启用前应充分混匀。 5、所用蒸馏水、去离子水应为新鲜的和高质量的，自行配制的缓冲液必须调整其pH 值和离子强度等。 6、HCVAb及HIVAb最好准备两家检测试剂盒，以便于对异常结果的复检。 二、分析中 （一）不同实验原理的ELISA实验中需要注意的问题 1、间接法： （1）间接法ELISA测定的仅为IgG类，由于机体的IgG类抗体浓度较高，其中绝大部分为机体接触外界环境刺激所产生的非特异IgG （2）为避免这些高浓度的非特异IgG对固相的吸附所致的假阳性反应，通常需要对待测样本做一定程度的稀释，如HCVAb的检测； 2、夹心法： （1）双抗体夹心测抗原： 1）钩状效应：两步法可避免； 2）RF的干扰：如HBsAg的检测，使用抗体的Fab片段作为酶标记用抗体可避免； （2）双抗原夹心测抗体：一般不易出现钩状效应，如TP-Ab的ELIS