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ＤＮＡ序列分析［本章摘要］??? ????DNA 的序列分析有两种基本方法， Maxam-Gilbert 化学降解法和 Sanger 氏酶学法。因为测序每个反应读取的序列是有限的，做长片段 DNA 或基因组测序时，需要选用一定的策略。测序的策略有 primer walking ，随机测序，定向测序等。现在全自动测序仍然沿用 Sanger 氏酶学法，但是在标记上作了改进。 DNA 测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息。第一节　Maxam-Gilbert 化学降解法 1977年， A.M. Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的测定方法，其原理为：将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基（表 6-1），从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 Maxam-Gilbert 化学降解法测序原理如图 6-1 ： ??????????????????表6-1：Maxam-Gilbert化学降解法测序的常用化学试剂： 碱基体系 化学修饰 试剂 化学反应 断裂部位 GA + GC + TCA C dimethyl sulphate（硫酸二甲酯）Piperidine formate（哌啶 甲酸）, pH2.0hydrazine + NaCl（1.5M）90(C, NaOH（1.2M） 甲基化脱嘌呤打开嘧啶环打开胞嘧啶环断裂反应 GG和AC和TCA和C ????硫酸二甲酯[dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3O）2SO2]是一种碱性化学试剂，可以使 DNA 链上的腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化，但是鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍，并且在中性 pH 环境中， DMS 主要作用于鸟嘌呤 G ，使之甲基化，导致糖苷键断裂。??? 哌啶甲酸可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致 DNA 链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。??? 肼，又称联氨 NH2.NH2 ，在碱性环境中作用于胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2M NaOH），肼则主要作用于胞嘧啶 C ，使之断裂。???? 作为标记用的放射性同位素主要有 γ-32Ｐ（[γ-32Ｐ]ATP，[γ-32Ｐ]GTP. [γ-32Ｐ]TTP ，或[γ-32Ｐ]CTP），或 γ-33NTP ， S-35NTP 。??? Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序；化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G ， C 含量较高的 DNA 片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。??? 化学降解测序法既可以标记 5-末端，也可以标记 3-末端。如果从两端分别测定同一条 DNA 链的核苷酸序列，相互参照测定结果，可以得到准确的 DNA 链序列。 Sanger 氏酶学法双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的 3 位置的 -OH 缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA 多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与 DNA 合成，以其 5 位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的 3 位置的 -OH 结合，但是，由于它自身 3 位置 -OH 的缺失，至使下位核苷酸的 5 磷酸基无法与之结合。如图 6-2 所示。??? 图 6-2 ：双脱氧核苷酸 （ddNTP） 分子的结构及 DNA 链合成终止反应???A.正常的 DNA 合成反应； B.ddNTP 掺入到 DNA 合成反应后导致反应终止  DNA 片段序列分析的策略 一、DNA 片段序列分析的策略?1．Primer walking????原理：将待测 DNA 克隆于噬菌体载体（M13）上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化（DNA 片断化的手段通常有超声波处理和酶切），得到两端彼此重叠的部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。原理图示如6-5： 3．定向测序　????定向测序的基本策略是沿着目的 DNA 的同一个方向逐渐向前推进，直至目的 DNA 的另一端。可采用嵌套缺失法或引物依次推进法。????嵌套缺失法是利用缺失随机突变原理，先将目的 DNA 克隆到载体上，再用限制性内切酶在邻近其一端处切断载体，使之变