DNA序列和大规模DNA测序策略的探讨.docVIP

第四章 DNA序列和大规模DNA测序策略的探讨 人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成，人类基因的 定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方 法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高， 大大推进了大规模DNA测序的进程。 大规模DNA测序是在低分辨率遗传图谱和物理图谱宣告完成之后，在酵母和线虫的 成功测序上开始的。截至1997年9月，大肠杆菌(Blattner FB等，1997)、酵母(Goffeau A ，1 996)和11种微生物(Fraser CM等，1995；Bult CJ等，1996；Himmelreich R等，1996)的测 序已被完成。此外，线虫(http://genome /gsc/gschmpg.html)、果蝇(http://f /.)小鼠和人类测序工作已部分完成。至2000年4月，人类基因组和模 式生物基因组的DNA测序又前进了一大步。 第一节 DNA测序的基本方法 一、Maxam-Gilbert的化学降解测序法 这种方法的关键是用特定的化学试剂降解特异性碱基，使DNA单链被分解，根据电 泳迁移率不同，最终确定DNA序列。化学测序时，①先用限制性内切酶把DNA切成10—200bp 的测序材料，②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸，③在5′OH端标记 32P，用多 核苷酸磷酸激酶催化，④标记片段变性为单链，⑤化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA， 产生一组长度不等的DNA片段，⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读， 待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。(见图5-2) 图5-2 化学降解测序法(Maxam-Gilbert) 单链DNA被分装在四个反应管，每管含有不同的特定化学试剂，使每管中的DNA单 链在特定的碱基位点发生部分断裂。第一管中的反应试剂可特异性断裂鸟嘌呤的磷酸二 酯键，不完全反应条件又使管中的单链DNA分子分别在不同鸟嘌呤碱基上断裂。由于断裂位 点的不完全性和随机性，造成在每个鸟嘌呤碱基处断裂的单链分子均会出现，每个单链DNA 分子 断裂后至少形成两段，其中只有一段带有放射性同位素标记；第二管中的反应产物除了具有 上述一系列片段外，还有一套在腺嘌呤碱基处断裂的片段；第三管产生两套分别在胸腺嘧啶 和胞密啶处断开的片段；第四管的降解产物是一系列在胞嘧啶处断裂的片段。反应结束后 ，四管反 应产物分别进行电泳，通过放射性自显影和X胶片感光后的带纹直接读出DNA碱基序列。其 中越小的片段在凝胶上走的速度越快，所以在第一管的三条带纹确定是G后，第二管的带纹 应是A或G，比照第一管确定出G后，G下面的二条带为A碱基的带纹，第三管点样的电泳带反 映的碱基为T或C，根据第四管C碱基的带纹再确定T碱基的显带。 二、Sanger的酶降解测序法(链终止法) 这项技术的关键是在DNA的聚合过程中依赖特殊反应底物(2′3′—双脱氧核苷三 磷酸ddNTP)的特异性终止进行DNA测序。 DNA顺序测定中常用的终止剂是ddNTP，它与dNTP(2′—脱氧核苷三磷酸)的区别是3′位又脱 去一个氧原子，只留一个氢原子。在DNA合成时，链终止剂从正常的5′端掺入增长的DNA链 中，一经掺入，由于3 ′位无羟基，链的进一步延伸被终止。由于掺入的终止剂分别是带有四种碱基的核苷酸，所以，最终形成以四种碱基为末端的DNA片段。 主要过程是：用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其 变性。选择 一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。引物先同单链模板复性。在 四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、不同的dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶)以及各种ddNTP。反应管中的dNTP在Klenow酶的作用下继续进行聚合反应 ，DNA新生链延长，当掺入ddNTP时，聚合反应终止。在A管中，当dATP掺入DNA新生链 时，DNA链继续延 伸，而ddATP掺入后，聚合反应立即终止。由于模板DNA的大量存在，在DNA模板链的T位置均 存在相应的新生链部分聚合反应产物，它们由一系列以A为末端的不同长度的DNA片段组成。 同理，在ddCTP、ddGTP、ddTTP的反应管中，也相应地合成三套分别以C、G和T为末端的不同 长度的DNA片段(见图5-3)。第一反应管加ddATP，则所显的条带应是与A互补的碱基T。同 时；第二管加ddTTP，电泳显带反应与T互补的碱基A；第三管加ddGTP，第四管加ddCTP，则 电泳显带分别为C和G，根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出  图5-3 Sanger的酶降解测序法 DNA序列