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ELISA实验常见问题 问题 可能原因 解决方法 无颜色 试剂孵育的时间没有按说明书操作 确定生物素抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当 不同试剂盒或不同批号的试剂混用 重新检查试剂的标签，确准所有组份都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂 漏加酶或显色剂 检查操作流程，注意不要漏加 HRP酶污染了叠氮钠 使用新配制的试剂，禁含叠氮钠 标准品有问题（若在标本孔中有信号） 按说明书检查标准品的制备 使用新标准品 某一容器未洗净，残留灭火酶物质 尽可能用试剂盒内容器，另觅一定要洁净、可靠 使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体 重新确认所选用的试剂 试剂配制/使用有误 将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。 缓冲液污染 配制新新鲜的缓冲液 显色弱 显色弱 加入试剂的体积和时间有误 确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。 试剂、样品用前未能平衡 用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右 缩短孵育时间能使实验的信号变弱 检查温育的时间 在温度变化的环境内孵育酶标板 确定孵育的温度，应避免温度的变化 使用了被污染的试剂 检查试剂是否被污染 标准品/标本制备方法不规范 检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用NaN3防腐，抑制了酶的反应。 显色底物制备不规范 检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。 检测时间不当 是否在规定的时间内检测。 仪器设定不正确，滤光片不匹配 检查仪器是否设定正确，滤光片的使用等 高背景（本底） 洗涤操作不规范 洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否正确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。 实验中孵育温度和时间不适当 确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当 酶加量过多 加酶前验看移液器调节量是否准确。检查稀释度，若必要进行效价测定 封闭不完全 检查封闭液的计算量；提高封闭时间 标本或标准品中的干扰物质 做适当的对照 显色剂受光照时间较长，或污染 显色剂A和B应于使用前10分钟从冰箱取出 整批样品放置时间过长，样品污染 样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染 高背景（本底） 缓冲液污染 制备新鲜的缓冲液 吸头重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂 吸头尽可能一次性使用 高CV值（CV： Coefficient of variation），花板 操作不慎或洗涤不充分 按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述 出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用 确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。使用封板膜封口，注意每步使用新鲜的封板膜。 由于操作失误或板子质量差（结合不均匀）造成包板不均匀。 稀释用的PBS中不要加其它蛋白，检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板） 移液器不准确，吸头重复使用 检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。 样品离心处理不全，反应孔内发生凝集或残留细胞成分 标本充分离心，严禁使用凝血（溶血）标本 缓冲液污染 制备新鲜的缓冲液 标准曲线可 得到，但两点之 间区别很差（低 或平地曲线） 酶结合物不足 检查稀释度，必要时进行效价测定 捕获抗体没有很好结合到板上 检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）稀释用的PBS中不要加其它蛋白 检测抗体不足 检查稀释度，必要时进行效价测定 板子显色不足 延长底物孵育实验 使用推荐品牌的底物溶液 操作不慎 回顾ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序 标准曲线稀释度计算有误 核查计算的情况，制备新的标准曲线 标准曲线很好 但是没有任何期 望的阳性信号产生 在标本中无相应的细胞因子 使用内参照重复实验，重新考虑实验的相应参数 标本基质遮盖检测 将标本至少做1:2相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性 标准曲线很好 但是标本的判读 值很高 标本中含的细胞因子水平超过实验范围 将标本做稀释并再次实验 当使用HRP酶 结合物时，TMB 底物加终止液后 显绿色 孔中的试剂显色不充分 轻轻震荡板子 边缘效应 工作环境温度不均衡 避免将板子在变化温度环境中孵育 漂移 实验过程