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ELISA操作流程 前处理 1．匀浆样本： 取一定量（约100-150g）的样本进行匀浆，匀浆样本以无颗粒状为为佳。样本匀浆好以后再利用称样勺搅拌样本，以充分混合不同个体的样本，达到均质的效果。 2．称量样本： 利用0.01g当量的电子天平称量相应的样本重量，误差尽量控制在±0.02g,以提高结果的准确度。样本直接称取到50ml离心管中。称量的样本应尽量称取匀浆效果比较好的样品。 3．加入提取液： 在相应的样本中加入对应的提取溶剂，溶剂的体积在条件允许范围内尽量精确。 4．提取或萃取： 加入相应的提取溶剂以后，拧紧离心管盖，利用涡旋仪充分振荡样品，以样本与提取液充分混合为准。具体时间可参考说明书所提供的方法时间要求。 5．离心： 把处理好的样品对称放置在离心机中，盖上离心机盖门，直到听到离心机盖门关闭声音，按“离心”键进行离心，离心时间一般设为5min，离心速度一般设为4500rpm/min。如果样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。 6．移取液体： 利用加样枪移取对应的的溶剂液体至另一个容器中；如果需要吹干浓缩的样品，则移取到干净干燥的玻璃管中；如果是取下层进行分析的样品则移取全部上层液体，利用下层进行分析。移取液体的时候请注意避免移取到不相关的液体层，以免造成污染。 7．浓缩吹干： 先利用甲醇把氮吹仪的针头进行润洗，具体方法是先打开空气压缩机的开头，先通以少量气流，把装有甲醇的容量浸泡针头前端，浸泡时间约1-2s即可。润洗针头后，把装有样品的玻璃管放在下面水浴锅的相对应的固定夹子上，再打开气流阀门，以能感觉到气流声音为准，再缓慢把针头伸到液面上方，以吹动液面为限，在浓缩吹干过程中应不断调整针头的高度，以节省吹干时间。吹干的样品以没有液体流动的判定依据，亦可在吹干后再吹大约2-3min左右。严禁在没有吹干的情况下就取下样品进行下一步操作。 8．复溶： 加入对应的复溶工作液后，再加入相应的除杂溶剂，利用涡旋仪振荡溶解，此步骤时间不宜过长，大约10s左右即可。 样本分析 1．回温平衡： 在加样之前约半小时左右，把试剂盒从冰箱中取出，放置在室温下进行平衡，平衡到用手握住试剂瓶感觉到不凉为止。如果时间匆忙的话也可以利用手握住试剂瓶进行快速回温。 2．加样： 取出相应数量的微孔板放置在板架上，然后再对板孔进行编号，再对需要稀释的抗体或酶标记物进行稀释。在板孔的前六个孔内分别加入标准品1-6，然后在剩下的板孔内加入样品分析液。然后再在每孔内加入其余需要加入的液体。盖上盖板膜以后小幅度振荡，然后放置在相应的环境中进行反应。如是25℃环境反应，则可放置在空调房内进行反应；如果是37℃环境下反应，则必须放置在37℃恒温培养箱里进行反应，如果是4℃环境下反应，则必须放置在2-8度冰箱里进行培养。 3．反应时间： 尽量把时间控制在需要的反应时间，如果时间比较紧迫的话也可以把时间稍微延长几分钟，但不宜太长。显色时间可根据颜色深浅进行调整。 3．洗板： 把板内液体甩干，加入稀释好的洗液250ul/孔，静置10s或稍作振荡后甩掉孔内液体，再次加入洗液，以此重复3-4遍，洗完以后利用吸水纸把孔内液体充分拍干后进行下一步操作，如果孔内有气泡，则利用干净的枪头刺破。 4. 结束实验: 把加样枪全部调到最大量程,试剂盒放入冰箱,试管及离心管进行清洗,关闭不用的仪器. 详细项目的SOP请见附录部分！ 附录： 氯霉素 操作步骤 完成与否 1．称取3g±0.02g样本于50ml离心管中； 2．利用移液管或加样枪加入6ml乙酸乙酯； 3．盖上离心管盖，利用涡旋仪振荡1min左右； 4．把振荡好的样品对称放置于离心机中，按照4500rpm/min离心5min； 5．离心结束后小心取出样本，小心取4ml于10ml干净干燥燥玻璃管中； 6．把取出后的样本放在氯吹仪上吹至完全干燥；拿出试剂盒回温； 7．把浓缩复溶液用去离子水1：1稀释备用；可适当多稀释一点； 8．取出吹干的玻璃试管，分别加入稀释好的复溶液和正已烷各1ml； 9．把加入溶液的试管利用涡旋仪复溶，振荡10s左右； 10．把复溶好的样品试管对称放在离心机中，按照3500rpm/min离心5min； 11．小心取出离心过的样品，利用加样枪去除上层正已烷层； 12．在板架上放置需要的板孔数目，板孔数目为样本个数+6 13．把抗体利用稀释好的复溶液按1：10的比例稀释，混匀备用； 14．在前六个孔内分别加入50ul标准品1-6，其余孔内分别加入样本各50ul 15．在所有的板孔内加入50ul稀释好的抗体工作液； 16．盖上盖板膜，轻轻振荡后