GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立.docVIP

GDNF因子受体Cerebral palsy?disease) 。本研究选取外源性脑神经因子(GDNF)外源性, 以聚合酶链式扩增相结合技术Cerebral palsy?disease)提供依据。 一、研究过程 1.大鼠脑神经细胞多巴胺(dopamine,DA)、 酪氨酸激酶 (RET)的分离培养与鉴定。 　 无菌解剖分离大鼠侧中脑, 分离制备多巴胺(dopamine,DA)、 酪氨酸激酶 (RET)单细胞悬液。以2 ×105 个/ml的密度完全培养液(DMEM/F12、1% N2 、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF)、37℃ 5% CO2 培养, 3 ～ 4d半量换液, 5 ～ 7d以1 ×105 个/ml的密度传代。取第3代神经球进行Nestin(Abcam)免疫细胞化学鉴定。 2．GDNF因子修复鼠神经元机制的建立 转染前1d离心收集第3代神经球, 分离制备单细胞悬液, 106 个/孔(2ml)接种6 孔板, 37℃ 5% CO2 培养18 ～ 24h。取质粒pEGFPN1-GDNF 2μg、FuGENE HD 转染试剂(Roche)6μl加入100μlOpti-MEM I低血清培养基(Ivitrogen)中, 充分混匀后室温静置15min形成转染复合物, 将其均匀滴加于神经细胞培养基中, 轻轻晃动培养板使之混合均匀。37℃ 5%CO2 培养72h后以1 ×105 个/ml的密度传代, 更换含有G418(100μg/ml, Ivitrogen)的神经细胞培养液进行筛选，荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。 3、神经细胞修复免疫细胞化学鉴定。 常规提取总蛋白各60μg进行15%SDS, 电泳结束取出凝胶, 用转印仪将蛋白转移在硝化纤维膜上。转移膜经5%脱脂奶粉封闭后, 分别与兔抗GDNF多抗(Abcam)、HRP标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)孵育, 然后与LumiGLO化学发光底物(KPL)孵育后X光片直接曝光。以神经细胞分化培养液(DMEM/F12、1%N2 、1%胎牛血清)重悬,接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的培养板中, 37℃ 5%CO2 培养7d后进行β-III-Tubulin、TH、GFAP和GDNF(Abcam)免疫细胞化学鉴定。设置转染质粒pEGFPN1和不转染基因的细胞，为阴性对照。 二、研究结果分析 GDNF基因修复鼠脑神经细胞机制建立后12h可观察到脑神经网络发育逐渐健全。 GDNF基因修饰mNSCs的诱导分化 GDNF基因修饰mNPCs体外诱导分化7d后免疫细胞化学染色显示细胞可分化为β -III-tubulin免疫阳性的神经元、TH免疫阳性的DA能神经元和GFAP免疫阳性的星形胶质细胞, 分化后细胞仍然表达GDNF及EGFP。 多巴胺(dopamine,DA)、酪氨酸激酶 (RET)明显增加，在吸取、修复、激活、增殖和分化中正常生长。3分钟后EGFP阳性细胞激活、再生, 5小时细胞克隆增大形成神经球，10分钟后达到顶峰。pMD19-GDNF经HindIII、BamH I双酶切后, 可见652bp和2.7kb两条带, 与预期结果一致。一周后，免疫细胞化学染色显示细胞呈Nestin、GDNF免疫阳性，westernblot显示GDNF基因转染组GDNF高表达, 而阴性对照组则为GDNF低表达，脑发育功能恢复正常。 三、临床应用价值思考 GDNF对多巴胺(dopamine,DA)、 酪氨酸激酶 (RET)等神经元有特异性营养作用, 是目前防治脑瘫病 (Cerebral palsy?disease)最有前途的神经营养因子。本研究建立的GDNF基因能使染鼠脑受损神经细胞在分化培养液的作用下诱导分化成神经元和胶质细胞, 证明其有修复、存活、分化、增殖、更新、再生等多向潜能，是中枢神经系统基因治疗的理想载体。如将此法应用于脑瘫临床，对思维、语言、认知、行为、运动等功能障碍可取得满意疗效，为从解除病理根源上治疗脑瘫带来新的希望。 参考文献 1、陈宁《新生儿缺氧缺血性脑病血和脑脊液中Epo、Lac变化及临床意义》 中国医科大学 2002年 2、张鑫玉 《GDNF基因修饰对神经细胞损伤的治疗作用》 《中华神经疾病杂志》 2013年 3、孙元田《人神经营养素-4的原核表达与纯化》 四川大学 2005年 4、司聚同、刑录洲、王永潮 《人类cdc-2基因亚克隆及鉴定》中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编 1992年