免疫组化与原位杂交.pptVIP

如： 一抗: mouse anti-CD45 rabbit anti-CD20 二抗: FITC-goat anti-mouse IgG TRITC-goat anti-rabbit IgG (green) or TRITC-donkey anti-rabbit IgG (red) 优点：增加了敏感性。 缺点：需用3-4种抗体，且一抗不能来源于同一种属。由于所用 的抗体来源于不同种属，存在交叉反应的可能性，使用前 需进行种属间的交叉实验。 B)也可先完成第一套抗体显示第一抗原，再进行第二套抗体显示第 二抗原。 ②第一抗体来源于同一种属，可采取以下方法进行： A)在完成第一套抗体显示第一抗原及保存了相应的图像后，用微波 处理灭活第一套抗体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二 抗可以是来源于同一种属，也可以不是, 但须标记不同荧光染料。 B)在完成第一套抗体显示第一抗原后，用饱和的与第一套一抗同一 种属的免疫球蛋白封闭第一套抗体中二抗的未结合位点，再用荧 光标记的第二套一抗直接进行第二抗原的显示。 2.免疫荧光多重染色 理论上可以使用N个不同荧光染料标记的抗体检测N个不同抗原， 实际使用上受荧光显微镜设置的荧光通道限制。通常荧光显微镜 最多只能设置3-4个荧光通道。 1)直接法： 可直接用3个或3个以上不同荧光染料标记的一抗显示相应的抗原。 2)间接法: 优点：可在一标本上检测3个或3个以上不同的抗原。 缺点：由于不同种属来源的抗体间存在交叉反应的可能性大，非 特异性反应极高。 ①第一抗体来源于非同一种属，可用以下方法： A)先用3种或3种以上不同种属的非标记一抗孵育标本，再用不同荧 光染料标记的二抗各自结合一抗，一抗和二抗间不能有来源于同 一种属的抗体。 B)也可按先后顺序进行各套抗体显示各自抗原。 ②第一抗体来源于同一种属： 可在完成每套抗体显示各自抗原及保存了相应的图像后，用微波 处理灭活各套抗体,再进行后续不同荧光的各套抗体显示后续的 各个抗原。 此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。 二）免疫酶双重及多重染色 前提条件：必须预先去除内源性因数（如过氧化物酶，碱性磷酸 酶，生物素，亲和素等）的影响。应该提醒的是，目前尚无方法 去除内源性生物素和亲和素。 1.免疫酶双重染色 1)直接法： 先去除内源性因数(如过氧化物酶，碱性磷酸酶，生物素，亲和 素等)的活性, 再加不同的酶标记的抗体,以各自抗体标记酶的底 物反应显示抗原的分布。如用HRP-CD68 antibody 和 AP-CD105 antibody 检测炎症组织中的巨噬细胞和中性粒细胞,分别以DAB (棕色)和 fast red（红色）显色。 优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主的抗体。 缺点：敏感性低,必须用不同的标记酶及底物。 2)间接法: 优点：敏感性高。 缺点：特异性低。 ①第一抗体来源于非同一种属，可用以下方法： A)先用各自非标记一抗孵育标本，再加不同酶标记的二抗系统(如 HRP-polymer和AP-polymer,SP-ABC和SAP-ABC)及酶底物显示各自 抗原。二抗系统可以是来源于同一种属，也可以不是，但必须标 记不同的酶。 B)也可先完成第一套抗体系统显示第一抗原，再进行第二套抗体系 统显示第二抗原。它们的二抗系统可以是来源于同一种属，也可 以不是，但必须标记不同的酶。 C)如欲使用PAP和APAAP的二抗系统，则二抗系统之间及二抗系统与 一抗之间不能有来源于同一种属的抗体。 ②第一抗体来源于同一种属： 可在完成第一套抗体显示第一抗原后, 用微波处理灭活第一套抗 体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二抗可以是来源于同 一种属，也可以不是,但必须标记不同的酶。 2.免疫酶多重染色 理论上可以使用N个不同酶标记的抗体显示N个不同抗原，实际使 用上受常用标记酶的限制。通常最常用的是过氧化物酶和碱性磷 酸酶，而酶的底物则相对多些。 1)直接法: 受常用标记酶的限制, 实际上只能直接用2个不同酶标记的一抗 显示相应的2个抗原。 2)间接法: 由于需用三套或三套以上抗体系统，抗体间存在交叉反应的可