第七章分子生物学技术.ppt

PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 本章小结 94℃ 55℃ 引物1 引物2 DNA引物 55℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 72℃ 第1轮结束 94℃ 第2轮开始 94℃ 55℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq 72℃ 第2轮结束 1. TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶能以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将4种脱氧核苷酸以碱基配对方式，按5′→3′方向，合成新的DNA链。这种酶的最适温度为70~75℃， 酶量一般为1~3U/反应管，过高会引起非特异性产物的扩增。 二、PCR反应体系 2.寡核苷酸引物 能与模板特异结合，引物设计的原则： ⑴引物长度，15~30碱基。 ⑵引物中碱基的分布是随机的。 ⑶避免两引物间的互补。 ⑷引物的碱基顺序不应与非扩增区互补。 ⑸引物的3’末端一定要与模板配对 ⑹其浓度通常是0.1~1μmol/L 3.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） dNTP稳定性好，使用浓度为20~200 μmol/L，且四种脱氧核苷酸浓度要接近。使用时要用NaOH调pH值7.0~7.5再分装，不要过多冻融。高浓度核苷酸会增加聚合的错误和成本，低浓度会导致反应速度下降，但可提高实验的精确性。 Mg2+可与dNTP结合，使游离Mg2+降低。要注意Mg2+浓度与dNTP浓度之间的关系。 4.PCR反应缓冲液 Tris-Cl(pH8.3~8.8)，KCl(50mmol/L)，MgCl2(1.5mmol/L)，明胶(0.1%)和甲酰胺(5%)。 其中Mg2+最为重要，其浓度可影响酶活性与精确度以及产物的特异性。 体系的pH为8.3~8.8是因为70℃时反应体系的pH会下降一个多单位，而pH低于7.0会影响聚合酶的活性。 KCl合适浓度能促进引物退火，但过高会抑制聚合酶活性。 明胶主要用来稳定酶活性。 甲酰胺主要用来加强反应的特异性。 5.模板DNA 要求不严格，主要避免标本间的交叉污染，模板中不能有聚合酶抑制剂。 6.PCR的循环数 一般为30个循环，过少产物量不多，过多非特异性产物会增加，标准扩增条件是94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。 三、PCR技术在医学上的应用 1.感染性疾病病原体的检测 如结核杆菌 2.遗传病相关基因的检测 如镰刀性红细胞贫血，可设计一对引物把包含突变的DNA片段进行扩增，扩增产物用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：正常人有2个片段即191和103，镰刀细胞贫血的纯合子只有1个片段即294，杂合子有3个片段即191、103和294）。 3.恶性肿瘤的诊断和研究 举例说明（缺失片段包含设计的引物） 核酸分子杂交技术是利用DNA变性后具有互补序列的两条单链在一定条件下，可通过碱基配对原则，重新聚合形成双链的原理。 包括DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA。 一、分子杂交 （一）探针的概念和特征 核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。 1. 要加以标记，带有示踪物。 2. 应是单链。 3. 具有高度特异性，只与靶核酸杂交。 4. 长度为十几到上千个bp。 5. 具有高灵敏度、稳定、标记方法简便。 （二）探针的种类及制备 1. 基因组DNA探针 一般从基因文库中选取某一基因片段，将其与质粒或噬菌体载体连接，进行克隆后酶切获得，也可用PCR来制备。 2. cDNA探针 这种探针是以特定mRNA为模板，经反转录获得cDNA后，进行克隆，即可作为探针使用。与基因组DNA探针相比， cDNA探针不存在内含子及其它高度重复序列，