基因工程常规技术-相互作用技术选读.ppt

双杂交原理 X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。 Reporter gene表达就可说明X基因产物与Y基因产物能结合。 GST pull-down 将GST融合蛋白(tagged protein (标记蛋白) or the bait (饵蛋白)，GST, His6, Flag, biotin …)作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein, or prey被捕获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 荧光共振能量转移 蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer 活体细胞中实时地对生物大分子之间的相互作用进行动态监测. 两个携带不同荧光基团（如GFP、YFP、RFP等）的大分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一个荧光基团（供体）向另一个荧光基团（受体）转移的现象。 * 图 相互作用研究技术 在细胞的生命活动过程中，诸如DNA的复制与重组、mRNA的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等，都涉及到了特定的DNA区段与蛋白质结合因子或者蛋白质因子之间的相互作用。为了分析研究参与基因表达调控的DNA元件，分离鉴定同这些调控元件结合的特异的蛋白质因子，近年来已相继发展出了一系列专门用于研究相互作用的实验技术。 DNA与蛋白质相互作用分析技术 蛋白质与蛋白质相互作用分析技术 染色质免疫沉淀技术（ChIP） 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是用于研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 甲醛处理使蛋白质与DNA交联 染色质打断 沉淀蛋白质-DNA交联复合体 解除交联，纯化DNA 分析 ChIP技术的发展 ChIP-on-chip ChIP-on-chip（定位分析）是一种基于芯片的强大方法，用于分析表观遗传修饰和结合到特异性调节蛋白的 DNA 序列。 简要地讲，在 ChIP-on-chip 中，要对蛋白质-DNA 复合物进行交联、免疫沉淀、纯化、扩增和标记，随后使之与多种高分辨率芯片进行杂交。 ChIP-Seq——基于ChIP的测序技术 首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的 蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组 上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。 凝胶阻滞试验(EMSA) 凝胶阻滞试验 (gel retardation assay)，又叫做DNA迁移率变动试验 (DNA electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，是80年代初期出现的用于体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种经典实验方法。 原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加分子量，而凝胶电泳中DNA朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，没有结合蛋白质的DNA片段跑得很快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。当特定DNA片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该DNA可能与提取物中某个蛋白质分子发生 了相互作用。 方法： 同位素标记待测的DNA片段 细胞提取物 DNA-蛋白质复合物 探针DNA 温育 PAGE电泳 放射自显影 进行DNA凝胶分析 EMSA可以通过加入超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA)鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子 (比如特异的转录因子等)，以及发生此种结合作用的DNA序列的特异性。 如果竞争DNA与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，不会出现阻滞的条带。 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用 (a)没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带； (b)加入的超量竞争DNA与探针DNA