基因工程的主要技术及其原理学习指导书.pptVIP

第四章 基因工程的主要技术及其原理(2) 聚合酶链式反应技术 DNA序列分析 DNA与蛋白质互作分析 第四节 聚合酶链式反应 PCR技术的发现： 1985年Kary Mullis及其Cetus公司的同事们，首次用大肠杆菌DNA 聚合酶I的Klenow片段体外扩增出哺乳动物基因片段。 他们因此获得1993年诺贝尔生理学和医学奖。 一、PCR技术原理 二、PCR反应体系（一）缓冲液 在PCR体系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl （pH8.3-9.0）， 其中的二价阳离子（通常为Mg2+）可以激活DNA聚合酶的活性中心， Mg2+的浓度可影响PCR扩增产物的特异性。 其中的K+（50mmol/L）利于引物与模板的退火。 明胶或血清白蛋白及去污剂（Tween20）起到对TaqDNA聚合酶的稳定作用。 3. Vent DNA 聚合酶 4. Pfu DNA 聚合酶 来自激烈热球菌（Pyrococcus fariosus），保真性和热稳定性都比较高，使用最广泛。 5. Pwo DNA 聚合酶 来自嗜热细菌（ Pyrococcus coesei），保真性和热稳定性都比较高，使用也比较多。 （五）引物 引物：在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸。 PCR引物设计应考虑的几个问题： 1.引物长度。一般16~30个核苷酸，最佳为20~24bp。引物过短会使PCR的特异性降低。 2. 引物中G+C的含量 在40~60%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。 3. 两个引物之间不应发生互补。互补不应大于2bp。 4. 引物内部避免形成次级结构，尤其发卡结构。引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 5. 引物的延伸从3′端开始， 3′端不能进行任何修饰， 3′端的最佳碱基选择是G和C。 6. 引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记。 7. 引物3 ′端不要终止于编码区域密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，影响扩增特异性和效率。 荧光扩增曲线可以分成三个阶段： （1）荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。 （2）荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以定量分析。 （3）平台期：扩增产物不再呈指数级增加。 实时荧光定量PCR的计算步骤： （1）临界点选择（荧光阈值） 可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 （2）临界点循环数 反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，被称为 CT 值。 （2）标准曲线的绘制 DNA序列测定，是指DNA一级结构的测定，即DNA分子中核苷酸的排列顺序的测定。 DNA测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立和发展起来的。 该凝胶含6%~8%丙烯酰胺，具有分离DNA片段的分子筛效应,能分离仅有一个碱基差别,而长度达300~500个碱基的寡核苷酸片段。 基本原理： 首先，对待测DNA片段进行单侧末端的放射性核素标记。 其次，标记后的DNA分成4份，分别用不同的化学试剂处理，使DNA片段分别于某一种或某一类碱基处断裂，结果可产生4种起始于放射性标记末端的不同长度的标记分子。 最后，将反应混合物经PAGE凝胶电泳按大小分离，放射自显影后，便可根据X光片底板上所显现的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。 Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。 随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。 由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。 基本原理： （1）通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。 新掺入的脱氧核苷酸5’-P与前一核苷酸的3’-OH以磷酸二脂键相连。 （2）如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它的戊糖的2’、3’-碳原子上均无-OH。 它具有5’-P能与前一核苷酸的3’-OH以磷酸二脂键相连，但因不具有3’-OH，故不能同后续的dNTP相连，于是DNA链的合成就此终止。 （3）在4个反应管中同时加入模板、放射性标记的引物、 DNA聚合酶、 4种dNTP，分别加入4种不同的ddNTP。 这样各反应体系中即可形成一种全部具有相同的5’-引物端和一种以ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段。 DN