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一种新的微卫星PAGE显带方法 刘梦培1，田敏2，傅大立1*，傅建敏1，王彩霞2 （1.国家林业局泡桐研究开发中心，河南郑州 450003；2.中国林科院亚热带林业研究所，浙江富阳 311400） 摘要：文章提出了微卫星PAGE荧光染料显带法，并将其与琼脂糖凝胶荧光染料显带法与PAGE银染显带法进行了对比，结果发现该法分辨率高、快速高效、简单易行、背景清晰、兼具后两种方法的优点，是一种成功的DNA显带技术。 关键词：微卫星DNA；聚丙烯酰胺凝胶电泳；荧光染料显影；银染 A new method of microsatellite PAGE banding LIU Meng-pei1，TIAN Min2，FU Da-li1，FU Jian-min1， WANG Cai-xia2 1.Non-timber Forestry Research and Development Center ，CAF，Zhengzhou 450003，Henan，China；2. Research Institute 0f Subtr0pical Forestry，CAF，Fuyang 311400，Zhejiang，China Abstract: This paper proposes microsatellite PAGE fluorescent imaging method, compared with agarose gel fluorescent imaging method and PAGE silver staining method , The results showed that the method of high resolution, fast, efficient, simple clear background, both the advantages of the latter two methods, is a successful DNA banding. Key words: microsatellite DNA；PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)；Fluorescent imaging； silver staining simple sequence repeats，SSR )，是由1-6个碱基多次串联重复组成的核苷酸序列，在基因组间广泛分布，具有共显性、重复性好、多态性高、扩增结果稳定、检测手段简便易行等优点[1]，成功应用在物种的遗传多样性（genetic diversity）（genetic mappingPedigree analysis）[6、7]、遗传育种（Genetics and Breeding）Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）PAGE由Raymends和Weintraub 1959年创建，具有不易扩散、灵敏度高、分辨率高等优点[10]。银染技术是其常用的显影方法，常用的有Bassam银染法[11] 、Sanguinetti银染法以及在其基础上改良的一系列银染法，但银染法缺陷是步骤繁琐、耗时长、背景模糊、条带不清等，极易造成DNA 条带错判，从而产生分析误差。许多研究者针对这些问题做了大量研究，但只能达到改良的效果，并不能从根本上解决问题。本研究提出了微卫星PAGE的荧光染料显影法，试图从一个新的思路解决PAGE显带的问题。 1 材料和方法 1.1 材料 杏属不同品种幼嫩叶片；SSR引物UDP98-405，正向引物序列：5′-ACGTGATGAACTGACACCCA-3′，反向引物序列：5′-CCTACCGTCTCGTTTCTGAG-3′；GelRed核酸荧光染料。 1.2 PCR反应体系和程序 PCR反应体系总体积20?L，其中10×PCR Buffer 2.0?L、25mmol/LMgCl21.2?L、10mmol/LdNTPs MiX 0.4?L、5U/?LTaq DNA聚合酶0.3?L、10?mol/L的上下游引物各0.5?L、DNA模板0.5?L、ddH2O 14.6?L。PCR反应在Bio-Rad C1000T M Thermal Cycler型号的扩增仪上进行。ISSR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。试验于中国林科院亚热带林业研究所植物细胞工程实验室内完成。 琼脂糖凝胶电泳显带 PCR产物在浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上分离。核酸荧光染料采用GelRed ，采用前染的方法，GelRed 核酸荧光染料加到溴酚蓝上样缓冲液中，4?L PCR产物与2?L含有gelred的溴酚蓝上样缓冲液P