高效液相色谱.pptx

高效液相色谱---------- 原理与方法 第一节 基本原理和术语第二节 高效液相色谱系统第三节 正相和反相高效液相色谱第四节 其它高效液相色谱方法第五节 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤第六节 高效液相色谱的应用第一节 基本原理和术语 液相色谱是指流动相为液体的色谱，包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间冗长，因而未受到重视。20世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们又重新认识到液相色谱法可弥补的气相色谱法的不足之处。因此，自20世纪60年代末期，液相色谱得到重视。高效液相色谱的定性和定量分析原理和方法与气相色谱基本相同。 经典液相色谱（柱色谱）法使用粗粒多孔固定相，并装填在大口径、长玻璃管内。流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质和扩散速度缓慢，因而仅有低柱效、分析时间冗场。高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱仪，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，从而在短的时间内获得高柱效和高分离能力。 与气相色谱比较，高效液相色谱与气相色谱有许多不同之处。气相色谱具有选择性高、分离效率高、灵敏度高和分析速度快的特点。但它仅适于分析蒸气压低和沸点低的样品，而不适用于分析高沸点、高分子量和热稳定定性差的有机物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。这两种方法的比较可见下表。液相色谱和气相色谱的方法比较项目液相色谱气相色谱进样方式样品配成溶液，室温样品需要加热气化流动相液相气相输送流动相的压力2 ? 20 MPa0.1 ? 0.5 MPa固定相颗粒的大小5 ?10 ?m0.1 ? 0.5 ?m填充柱柱效103 ? 104102 ? 103毛细管柱效104 ? 105103 ? 104柱温常温常温 ? 300?C选择型检测器UVD, PDADFD, ECDECD, FPD, NPD通用型检测器ELSD, RIDTCD, FID应用范围--高效液相色谱的特点：分离效能高 由于新型高效微粒固定填料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达 2?103 ? 5?104 块/米理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱 103 块/米理论塔板数的柱效。选择性高 由于液相色谱柱具有高效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机物及其同分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体。检测灵敏度高 在高效液相色谱中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小间储量可达10-9g；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经典液相色谱，其分析时间大大缩短。完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。 高效液相色谱法具有上述优点，但也有下述局限性：在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，分析所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。但进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器，如热导监测器和氢火焰离子化检测器。近年来蒸发激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱法的一种通用型检测器。高效液相色谱法不能替代气相色谱法，对于要求柱效高达104 块理论塔板数以上的有机样品，必须用毛细管气相色谱法分析才有效。高效液相色谱法也不能代替中和低压柱色谱法，对于在高压下易分解和变性的具有生物活性的生化样品，不能使用高效液相色谱。基本术语（1）流动相液相色谱的流动相就是一种或多种溶剂混合的液体，通过色谱柱运动，携带被分离的组分，也就是通常所说的洗脱剂。大多数液相色谱分离是利用双溶剂作为洗脱剂，它们其中的一个往往对固定相表面的相互作用是惰性的。 对于反相高效液相色谱，其流动相中的一个溶剂是水，它与疏水的吸附剂表面不发生作用，不与组分竞争吸附剂表面的位置。对于正相高压液相色谱，其流动相中的一个洗脱剂往往是正己烷，也不与极性的硅胶表面相互作用。 任何一个双向溶剂中另外一个溶剂都是活性的，它与吸附剂表面发生相互作用，与被分析的组分竞争吸附表面的吸附位置，随着它的浓度的增加，导致组分的保留值降低。（2）固定相 固定相是表面带有刚性多孔的固体颗粒，也就是我们 所说的吸附剂。常见的有多孔硅胶以及多孔氧化铝。（3）分配系数 液相色谱中的分配理论完全符合气相色谱中的分配理论。色谱分离是在两相中进行的，可以用分配系数来描述。分配系数是在一定的温度和压力下，溶质分子依据它们在固定液和流动相中的溶解度，