单克隆抗体的制备和应用.pptVIP

第一节 杂交瘤技术的基本原理 第三节 基因工程抗体 双特异性抗体 细胞工程BsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。 　第四节　单克隆抗体应用 ①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； ②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； ③构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； ④表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 构建噬菌体抗体库 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液 融合方法 SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2-5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为0.5-1.5×105个。融合后7天，换用HT培养液。 细胞融合 10~20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆 融合细胞的早期培养 可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞） 筛选常用方法 ELISA ELISA 多头加样枪 。 免疫荧光法 体外培养 中空纤维培养系统? 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 动物接种 每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10 ╳105/只 生产单克隆抗体 细胞性抗原：1-2 × 107/只，不加佐剂，2-3周重复一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3-6周 100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫 免疫小鼠 腹腔注射法 前5天进行,预先腹腔注射pristane 1~5×106细胞 1~3w形成腹水 高滴度腹水 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 McAb的纯化 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot McAb的鉴定 McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 　　 稳定 　　低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低 McAb与PcAb的比较 McAb and PcAb 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。 基因工程抗体Genetic engineering antibody 将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体 人源化抗体 方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力 嵌合抗体 chimeric antibody 嵌合抗体 chimeric antibody 人抗体V区的骨架区 取代鼠源单抗CDR以外骨架区 改型抗体 reshaped antibody 定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源