单克隆抗体与基因工程抗体的制备.pptVIP

杂交瘤技术的基本原理 基本概念 抗原决定簇（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体 杂交瘤技术的理论基础 杂交瘤技术的基本原理 基因工程抗体制备 原理与操作技术 基因工程的操作技术 PCR技术原理示意图 抗原的原核表达 表达产物的分离纯化 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 包含体 细胞碎片分离 变 性 复 性 浓 缩 初步分离 高度纯化 发酵液 细胞分离 在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包含体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作 实验原理 试剂与器材 试剂 洗涤缓冲液（50mmol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA， pH8.0） 洗涤液（20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，2mol/L Urea， 0.5%Triton X-100，pH8.0） 溶解液（10mmol/L Tris-HCl， 8mol/L Urea，50mmol/Lβ-巯 基乙醇，1mmol/LMEDTA，pH8.0） 稀释液（3mol/L Urea， 10mmol/L Tris-HCl， pH8.0） 复性缓冲液（10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA， pH8.0） 器材 低温高速离心机、超声波粉碎仪、光学显微镜 材料 透析袋、烧杯等 实验步骤 包含体分离 包含体溶解 包含体复性 菌体裂解 包涵体洗涤 先用洗涤缓冲液离心洗涤菌体3次后用洗涤缓冲液将菌体稀释成1g/10ml浓度混悬液，在冰浴下超声破碎菌体，然后4℃、 10000g离心20分钟，收集包含体沉淀。 用包含体洗涤液离心洗涤包含体（4℃、10000g离心20分钟），2─3次，包含体洗涤液体积为包含体沉淀的20倍以上。 以每克包含体与50ml包含体溶解液的比例配成混悬液，室温搅拌15小时，然后15℃、15000g离心20分钟留取上清，即得血管抑素抽提液。 用稀释液将血管抑素抽提液稀释至蛋白浓度为500μg/ml，然后用40倍体积的复性缓冲液4℃下透析12小时，然后更换透析液继续透析24小时。 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术分为： Ion exchange chromatography (IEC) Reversed phase chromatography (RPC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC) 样品的层析纯化 实验结果 1 2 3 4 5 纯化前后的样品电泳图 1、2、纯化前样品 3、4、5、纯化后样品 小结 杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细?胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一?体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤?细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。 20世纪80年代诞生了应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体，它具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；②基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据治疗的需要，制备新型抗体；④可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。 其它生物活性蛋白融合 三、抗体融合蛋白 　 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。 四、双特异性抗体 定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性 五、噬菌体抗体库技术 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件