凝胶层析法测定蛋白质分子质量.doc

凝胶层析法测定蛋白质分子质量 一、实验目的 了解凝胶层析（Gel Chromatography）的原理及其应用。 通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶排阻层析（Gel Exclusion Chromatography），凝胶过滤（Gel Filtration），渗透层析（Gel Permeation Chromatography）或分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）。 在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子质量的变化而改变。分子质量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小则Ve值大，Kav值大。 有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要的参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，Kav和lgMr成线性关系： Kav = -blg Mr + C 其中b，C 为常数。 同样可以得 Ve = -b’ lg Mr + C’, 其中、为常数。可以通过在一凝胶柱中分离多种已知分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白的分子质量。 三、实验仪器和实验试剂 器材 玻璃层析柱。 HL-1型恒流泵。 BSE-100型自动部分收集器。 8823B紫外检测仪。 SPECORD-200紫外分光光度计。 TYPE3057 Portable Recorder记录仪。 100ml试剂瓶。 50ml、100ml量筒各一个。 50ml、100ml、250ml、500ml烧杯各一个。 10ml刻度试管。 胶头滴管。 玻璃棒。 （二）试剂 标准蛋白 牛血清白蛋白：Mr=67 000（上海生化所） 鸡卵清清蛋白： Mr =45 000（美国SIGMA公司） 胰凝乳蛋白酶原A：Mr =24 000 溶菌酶： Mr =14 300 未知蛋白样品（由实验室制备） 洗脱液0.025mol/L KCL-0.1 mol/L HAC 蓝色葡聚糖-2000 四、实验操作和具体过程 凝胶的溶胀 称取7g Sephadex G-75 于250 ml烧杯中加入洗脱液100ml，置于室温溶胀2~3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去处凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2~3小时（可去处颗粒内部的空气以及灭菌）。 装柱 取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 凝胶柱总体积（Vt）的测定： 在距离柱上端5cm处作一个记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt。 在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，流速一般用5~6ml/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1~2倍柱床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。 V0和未知蛋白Ve的测定 按实验要求