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凝胶层析法测定蛋白质分子质量
凝胶层析法测定蛋白质分子质量
一、实验目的
了解凝胶层析(Gel Chromatography)的原理及其应用。
通过测定蛋白质分子质量的训练,初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理
凝胶层析又称凝胶排阻层析(Gel Exclusion Chromatography),凝胶过滤(Gel Filtration),渗透层析(Gel Permeation Chromatography)或分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography)等。它是以多孔性凝胶填料为固定相,按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近似于球形)具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,而后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,即被部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(Vt)、外水体积(V0)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关:Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)。
在限定的层析条件下,Vt和V0都是恒定值,而Ve是随着分离物分子质量的变化而改变。分子质量大,Ve值小,Kav值也小。反之,分子量小则Ve值大,Kav值大。
有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要的参数,同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V0及Ve的值,从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子质量范围内,Kav和lgMr成线性关系:
Kav = -blg Mr + C 其中b,C 为常数。
同样可以得 Ve = -b’ lg Mr + C’, 其中、为常数。可以通过在一凝胶柱中分离多种已知分子质量的蛋白质后,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白的分子质量。
三、实验仪器和实验试剂
器材
玻璃层析柱。
HL-1型恒流泵。
BSE-100型自动部分收集器。
8823B紫外检测仪。
SPECORD-200紫外分光光度计。
TYPE3057 Portable Recorder记录仪。
100ml试剂瓶。
50ml、100ml量筒各一个。
50ml、100ml、250ml、500ml烧杯各一个。
10ml刻度试管。
胶头滴管。
玻璃棒。
(二)试剂
标准蛋白
牛血清白蛋白:Mr=67 000(上海生化所)
鸡卵清清蛋白: Mr =45 000(美国SIGMA公司)
胰凝乳蛋白酶原A:Mr =24 000
溶菌酶: Mr =14 300
未知蛋白样品(由实验室制备)
洗脱液0.025mol/L KCL-0.1 mol/L HAC
蓝色葡聚糖-2000
四、实验操作和具体过程
凝胶的溶胀
称取7g Sephadex G-75 于250 ml烧杯中加入洗脱液100ml,置于室温溶胀2~3天,反复倾泻去掉细颗粒,然后减压抽气去处凝胶孔隙中的空气,沸水浴中煮沸2~3小时(可去处颗粒内部的空气以及灭菌)。
装柱
取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
凝胶柱总体积(Vt)的测定:
在距离柱上端5cm处作一个记号,关闭柱出水口,加入去离子水,打开出水口,液面降至柱记号处即关闭出水口,然后用量筒接受柱中去离子水(水面降至层析柱玻璃筛板),读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt。
在柱中加入洗脱液(约1/3柱床高度),将凝胶浓浆缓慢倾入柱中,待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口,流速一般用5~6ml/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕,注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口,静置片刻,待凝胶完全沉降,则接上恒流泵,用1~2倍柱床体积的洗脱液平衡柱子,使柱床稳定。
V0和未知蛋白Ve的测定
按实验要求
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