- 1、本文档共7页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
乳鼠肾细胞的原代培养传代培养
乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养
目的要求
了解细胞原代培养、传代(继代)培养的基本方法和操作过程。
初步掌握培养过程中的无菌技术。
掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
用品
超净工作台
恒温培养箱
普通显微镜
例置相差显微镜
水浴箱、离心机
解剖剪、眼科剪
镊子(尖头、平头和有钩镊)
烧杯
培养瓶
离心管
吸管
血球记数板
酒精灯
单个仪器逐个弹出在屏幕上,小器械逐个弹出在超净台上
培养用品
RPM1 1640培养液(含小牛血清及青、链霉素)
RPM1 1640、0.25%胰蛋白霉、PBS,冻存培养液微热字显示
动物细胞及细胞系
新生乳鼠(小鼠)
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)
人宫颈癌细胞(HELA)
以上三个也为热字显示
乳鼠肾细胞原代培养
方法1—单层细胞培养法
所有组织中都有一定量的细胞间质(纤维和基质等),对细胞生长有妨碍作用,用胰酶消化能出去间质,使组织松散成单个细胞或小的细胞团,细胞易于生长。
步骤
培养用品消毒后,安放在超净工作台内,紫外线消毒,做好洗手等准备工作。
点燃酒精灯,用品按布局放置,安装吸管等
取材
取新生乳鼠一只,采用颈椎脱臼法处死,然后把这个小鼠进入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒,随即携入超净工作台内。
在超净工作台内取出小鼠,置于消毒培养皿中
打开消毒器械包
用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔,
用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏
取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中
用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污
再将肾组织用解剖剪剪成几块
再用PBS漂洗,去净血液为止
消化
将洗净的组织块移入消毒小瓶中(如毒霉素瓶)用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块
加入5-8倍量(体积)的0.25%胰蛋白酶,盖好放入37(C水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。
当组织块变得疏松,颜色略白时,取出置于超净工作台内
用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态
加入1-2ml培养液终止消化
净置片刻,让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入消毒离心管中离心
离心及计数
离心管平衡后,以800-1000转/分离心8-10分钟,超净工作台内开盖,吸取上清液
加入3-5ml培养液,盖盖,注意应有空隙,标明细胞名称,代数,日期。
在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后置37(C孵箱中培养
新生乳鼠(活)(新生乳鼠(死)(放在70%酒精烧杯中(被平放解剖(组织块在平器中(放入PBS清洗(组织块入小瓶中(被剪刀剪切(小瓶放入水浴箱中消化(小瓶中液体转移至离心管(离心机(人面容显微镜(计数细胞)(操作人向培养瓶中放液体(培养瓶被放入CO2孵箱。
这为一系列照片组成的动画效果显示。
原代培养细胞的观察
每天要对按种培养的细胞做常规性检查,观察的主要内容是:
污染与否
细胞生长状态
PH(通过培养液颜色变化)
如发现培养液变为黄色且又混浊,表明已被污染,这时细胞不易贴壁生长,逐渐死亡。
如培养液为桔红色,一般说明细胞生长状态良好
在没有发生污染的情况下,一般按规24h,可见到许多细胞贴壁,由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状。
培养3—4天时,细胞生长繁殖,数量增加,可见细胞形成孤立小片(细胞岛),逐渐扩展。细胞透明,颗粒少,界线清楚,状态佳。
由于细胞生长旺盛,代谢产物堆积,CO2增多,培养液逐渐变酸呈黄色,但液体澄清,此时换液一次。
大约7—10天,原代培养细胞可基本辅满瓶壁,形成致密单层,这时可进行传代培养。
方法II——组织块培养法
组织切成0.5—1mm的小块后,由于组织块体积很小,再不加任何粘着剂情况下,它们也能直接贴付与瓶壁上,然后细胞从组织块边缘向外长出生长晕,最后连接成片而形成单层细胞。此方法程序简化,是常用的原代细胞培养方法。
步骤
取材镊同单层细胞培养法
洗净的组织块移入消毒平皿中,也可用小瓶代替。用眼科剪反复剪成0.5-1mm小块
用吸管滴加几滴培养液,轻轻吹打混匀
用吸管分次吸取小碎块悬液,注意吸在吸管前端部,以免吸德过高,组织小块粘附与管壁而丢失
将组织碎块在培养瓶低上散开摇匀
然后翻转培养瓶,加入2-3ml培养液(15mm)盖好,标记好,置37(C孵箱中培养2-3hr
待组织小块略干燥,能牢固贴在瓶壁时,再慢慢翻转培养瓶,使培
您可能关注的文档
- 乳腺癌专家浅谈.doc
- 乳腺癌内分泌治疗的原理.doc
- 乳腺癌分子分型与治疗.doc
- 乳腺癌前哨淋巴结活检影响因素的临床研究写手代写初始材料.doc
- 乳腺癌基因治疗进展.doc
- 乳腺癌如何分期.doc
- 乳腺癌心理干预.doc
- 乳腺癌患者的心理状态调查及其护理对策.doc
- 乳腺癌放疗路径.doc
- 乳腺癌术后放射治疗临床路径(2012年版).doc
- 场地脚手架工程施工方案(3篇).docx
- 2024年浙江省丽水市松阳县玉岩镇招聘社区工作者真题及参考答案详解一套.docx
- 2024年河南省郑州市惠济区古荥镇招聘社区工作者真题及答案详解一套.docx
- 2024年浙江省杭州市淳安县文昌镇招聘社区工作者真题及完整答案详解1套.docx
- 2024年浙江省台州市三门县小雄镇招聘社区工作者真题带答案详解.docx
- 2024年浙江省宁波市余姚市河姆渡镇招聘社区工作者真题及完整答案详解1套.docx
- 2024年浙江省丽水市景宁畲族自治县雁溪乡招聘社区工作者真题及答案详解一套.docx
- 2024年浙江省杭州市临安市板桥乡招聘社区工作者真题及答案详解一套.docx
- 2024年湖北省宜昌市点军区土城乡招聘社区工作者真题及答案详解一套.docx
- 2024年浙江省台州市路桥区桐屿街道招聘社区工作者真题附答案详解.docx
最近下载
- 鲁教版初中八年级的上册英语短语句型.docx VIP
- 新人教版高中数学选择性必修第一册全套PPT课件及配套讲义.pptx VIP
- 四川省拟任县处级试题 四川省拟任县处级党政领导干部任职资格考试题.doc VIP
- 鲁教版八年级上册英语短语句型.doc VIP
- 最新人教版(2023年新版)信息技术四年级上册(含课后反思).pdf VIP
- 2025年广东省广州市高二下学期期末考试物理(理)试卷Word版含答案 .pdf VIP
- 简单的个人简历模板.pdf VIP
- 上消化道穿孔教学查房.pptx VIP
- 科研方法论知到智慧树期末考试答案题库2025年南开大学.docx VIP
- 2023山西临汾市永和县招用公益性岗位人员50人笔试备考题库及答案解析.docx VIP
文档评论(0)