乳鼠肾细胞的原代培养传代培养.docVIP

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乳鼠肾细胞的原代培养传代培养

乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养 目的要求 了解细胞原代培养、传代(继代)培养的基本方法和操作过程。 初步掌握培养过程中的无菌技术。 掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 用品 超净工作台 恒温培养箱 普通显微镜 例置相差显微镜 水浴箱、离心机 解剖剪、眼科剪 镊子(尖头、平头和有钩镊) 烧杯 培养瓶 离心管 吸管 血球记数板 酒精灯 单个仪器逐个弹出在屏幕上,小器械逐个弹出在超净台上 培养用品 RPM1 1640培养液(含小牛血清及青、链霉素) RPM1 1640、0.25%胰蛋白霉、PBS,冻存培养液微热字显示 动物细胞及细胞系 新生乳鼠(小鼠) 中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 人宫颈癌细胞(HELA) 以上三个也为热字显示 乳鼠肾细胞原代培养 方法1—单层细胞培养法 所有组织中都有一定量的细胞间质(纤维和基质等),对细胞生长有妨碍作用,用胰酶消化能出去间质,使组织松散成单个细胞或小的细胞团,细胞易于生长。 步骤 培养用品消毒后,安放在超净工作台内,紫外线消毒,做好洗手等准备工作。 点燃酒精灯,用品按布局放置,安装吸管等 取材 取新生乳鼠一只,采用颈椎脱臼法处死,然后把这个小鼠进入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒,随即携入超净工作台内。 在超净工作台内取出小鼠,置于消毒培养皿中 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔, 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏 取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中 用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污 再将肾组织用解剖剪剪成几块 再用PBS漂洗,去净血液为止 消化 将洗净的组织块移入消毒小瓶中(如毒霉素瓶)用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块 加入5-8倍量(体积)的0.25%胰蛋白酶,盖好放入37(C水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。 当组织块变得疏松,颜色略白时,取出置于超净工作台内 用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态 加入1-2ml培养液终止消化 净置片刻,让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入消毒离心管中离心 离心及计数 离心管平衡后,以800-1000转/分离心8-10分钟,超净工作台内开盖,吸取上清液 加入3-5ml培养液,盖盖,注意应有空隙,标明细胞名称,代数,日期。 在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后置37(C孵箱中培养 新生乳鼠(活)(新生乳鼠(死)(放在70%酒精烧杯中(被平放解剖(组织块在平器中(放入PBS清洗(组织块入小瓶中(被剪刀剪切(小瓶放入水浴箱中消化(小瓶中液体转移至离心管(离心机(人面容显微镜(计数细胞)(操作人向培养瓶中放液体(培养瓶被放入CO2孵箱。 这为一系列照片组成的动画效果显示。 原代培养细胞的观察 每天要对按种培养的细胞做常规性检查,观察的主要内容是: 污染与否 细胞生长状态 PH(通过培养液颜色变化) 如发现培养液变为黄色且又混浊,表明已被污染,这时细胞不易贴壁生长,逐渐死亡。 如培养液为桔红色,一般说明细胞生长状态良好 在没有发生污染的情况下,一般按规24h,可见到许多细胞贴壁,由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状。 培养3—4天时,细胞生长繁殖,数量增加,可见细胞形成孤立小片(细胞岛),逐渐扩展。细胞透明,颗粒少,界线清楚,状态佳。 由于细胞生长旺盛,代谢产物堆积,CO2增多,培养液逐渐变酸呈黄色,但液体澄清,此时换液一次。 大约7—10天,原代培养细胞可基本辅满瓶壁,形成致密单层,这时可进行传代培养。 方法II——组织块培养法 组织切成0.5—1mm的小块后,由于组织块体积很小,再不加任何粘着剂情况下,它们也能直接贴付与瓶壁上,然后细胞从组织块边缘向外长出生长晕,最后连接成片而形成单层细胞。此方法程序简化,是常用的原代细胞培养方法。 步骤 取材镊同单层细胞培养法 洗净的组织块移入消毒平皿中,也可用小瓶代替。用眼科剪反复剪成0.5-1mm小块 用吸管滴加几滴培养液,轻轻吹打混匀 用吸管分次吸取小碎块悬液,注意吸在吸管前端部,以免吸德过高,组织小块粘附与管壁而丢失 将组织碎块在培养瓶低上散开摇匀 然后翻转培养瓶,加入2-3ml培养液(15mm)盖好,标记好,置37(C孵箱中培养2-3hr 待组织小块略干燥,能牢固贴在瓶壁时,再慢慢翻转培养瓶,使培

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