免疫学检验中的酶免疫技术.doc

免疫学检验中的酶免疫技术 ?????? 20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。 ??? 目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。 一、常用的酶及显色底物 ??? 在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。 表1 常用酶及底物 常用酶 底物 加终止液前颜色 加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 二、标记物的制备 ??? 在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。 制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。标记物制备的方法基本属于两类： （一）?? 交联法 ??? 交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的 交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原） （二）?? 直接法 ????直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。形成的结合物为：酶-抗体（抗原）。 三、酶免疫技术类型 ??? 酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在于液体样品中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定（EIA），酶免疫测定又可分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。 （一）?? 均相酶免疫测定 ??? 均相酶免疫测定是利用酶标记物结合成抗原抗体复合物后，标记酶的活性就受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量的一种技术。常用于半抗原或小分子抗原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。常用的技术类型有： ????? 1．酶免疫增强测定技术（EMIT）：酶免疫测定增强技术中酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶与底物结合的部位而造成的。反应模式常用竞争法，即当未标记抗原多，竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高。因此，最终测得的酶活性与未标记物的含量呈正相关。见图1。 ? ? ???? 2．克隆酶供体免疫分析（CEDIA）：克隆酶供体免疫分析中酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结合在一起形成全酶才能具有活性，当标记了供体酶的抗原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（ED）与酶受体（EA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑制。在反应模式上同样为竞争性结合分析方法，最终测得的酶活性与未标记抗原的含量呈正相关。见图2。 ? ? ? （一）?? 异相酶免疫测定 ??? 异相酶免疫测定与均相酶免疫测定的最大区别是抗原抗体反应平衡后，在反应体系中同时存在着游离的和结合的两种酶标记物，两种标记物上的酶都具有酶活性，而只有结合的酶标记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量。因此，需将游离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标物的活性推算待测物的含量。因分离游离和结合的标记物的方法不同，异相酶免疫测定又分成液相酶免疫测定和固相酶免疫测定两类方法。液相酶免疫测定，