研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性.pptVIP

一、研究目的和意义 Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定性作用。本课题拟以小麦为实验材料，采用ELISA测试技术，研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性，这些结果将有助于进一步阐明Rubisco 及Rubisco活化酶的作用机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。 二、选题依据 Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的热点问题，如何提高作物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、菠菜作为研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容较少，尤其有关小麦Rubisco活化酶的研究仍然是国内外研究中的空白。 创新之处 本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确而简易的定量测定Rubisco和 Rubisco活化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量的变化。进一步对Rubisco和 Rubisco活化酶做深入的研究。 三、研究内容 四、 材料、仪器和方法 1、材料与仪器 1.1 材料 植物材料 扬麦5号 动物材料 新西兰大白兔 1.2 试剂与仪器 高速冷冻离心机 液相层析收集系统 垂直板电泳系统 Beckman LS-9800液体闪烁仪 酶联免疫测定仪…… 3、 Rubisco及Rubisco活化酶抗体的制备 3.2 采血 用心脏取血的方法采血 4、 ELISA法测定酶含量 五、实验进展 六、研究计划 * Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备及其在作物中的应用 研 究 生: 陈 相 辉 导 师: 王忠教授 专 业: 植 物 学 Rubisco和Rubisco活化酶的提取和纯化 Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备 Rubisco和Rubisco活化酶ELISA标准曲线的制定 C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比较及其与光合作用的关系 光暗处理对小麦光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影响 施氮处理对小麦光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影响 Rubisco和Rubisco活化酶单克隆抗体制备初探 试验设计流程 Rubisco和 Rubisco活化酶的分离提纯 Rubisco和Rubisco 活化酶抗体的制备 抗体的分离与纯化 利用抗体定量测定不同处理下Rubisco 及Rubisco活化酶的含量 2、酶的提取和纯化 3.1 免疫过程: 以皮内多位点分数次注射法进行免疫 首次免疫 加强免疫 二次免疫 0.5ml抗原+0.5ml佐剂,皮内注射于兔子背部多个部位 三周后，0.5ml抗原+0.5ml佐剂,皮下注射于兔子背部多个部位 三周后，静脉注射0.5ml抗原 检测效价 一周后，耳缘静脉采血，检测抗体效价 3.3 分离血清 4℃下离心30min，除去红细胞，获得血清；或者将血液收聚在培养皿中，37℃放置6h，用吸管吸取析出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下20℃，或加0.1%NaN3或0.01%硫柳汞后，储存于4℃冰箱中。 Rubisco和Rubisco活化酶的定量测定 用一系列已知浓度的标准抗原（ Rubisco和Rubisco活化酶）与制备的Rubisco和Rubisco活化酶的抗体反应，制成一条标准曲线，再将待测样品与之相比较，求得样品中抗原的含量 Rubisco含量（mg·g-1FW）=[提取液（mL）+鲜叶重（g）]×稀释倍数 ×由标准曲线计算的Rubisco浓度/叶片鲜重 5、 蛋白质含量的测定 依Folin-酚试剂法（薛应龙，1985）测定，以BSA作标准曲线 6、光合速率和叶绿素含量的测定 光合速率用便携式光合速率测定仪测定 叶绿素含量用分光光度计测定 1 、 Rubisco的提纯和纯度鉴定 Rubisco的电泳图谱 A为Rubisco的ND图谱 B为Rubisco的SDS图谱 55 000 14 800 2、 小麦Rubisco活