分子生物学实验讲义.docVIP

《生化与分子生物学》 实验讲义 天津医科大学生物医学工程系 2005年 实验一 自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA 一、实验目的 1、了解核酸的基本特性。 2、掌握DNA提取和鉴定的方法。 二、实验原理 核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。 核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA为双链线性分子，存在于细胞核内。基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。 分离纯化核酸的总原则： 保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在一级结构中。 排除其它分子的污染。 对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。 生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。 其它核酸分子：RNA. 三、实验试剂 1、TKM缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羟甲基氨基甲烷） 10 mmol/L KCl 2 mmol/L EDTA 4 mmol/L MgCl2 2、TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA pH 8.0 3、10％SDS 4、饱和氯化钠 四、实验步骤 1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清洁的1.5ml Eppendorf离心管中。 2、加入0.5ml TKM缓冲液，13μl Triton X-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。在台式离心机上离心，5,000rpm×10分钟。（低渗破红细胞膜）。 3、 倾去上清液，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，5,000rpm×10分钟，重复步骤3两次。（清洗） 4、于沉淀中加入200μl TKM缓冲液和15μl 10％SDS（终浓度为0.7％），混匀后于55℃保温20分钟。（破白细胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。 5、于离心管中加入75μl 饱和（≈6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为1.2 mol/L），混匀。13,000 rpm离心5分钟。（沉淀蛋白质） 6、小心吸取上清液约240μl转移至另一洁净的1.5ml Eppendorf离心管中。加入750μl 95％的冷乙醇（终浓度为71％），－80℃放置30min。离心1,5000 rpm×20分钟，最好在4℃。（沉淀DNA） 7、小心吸去上清，加入1.0 ml 75％的冷乙醇，洗涤沉淀，相同条件再离心一次。（脱盐） 8、弃去上清，用Parafilm膜封口，在膜上扎孔后置37℃温箱中干燥，以去除残余的乙醇。 9、将干燥后的DNA溶于50μl TE缓冲液中，置－20℃冰箱中备用；也可将干品置－20℃冰箱中备用，使用前用30μl重蒸水溶解。 OD260/OD280的测定。 五、注意事项 为保证核酸分离的完整性和纯度，实验过程中应注意以下事宜： 量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。 少化学因素对核酸的降解，避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏。 减少物理因素的核酸的降解，如机械剪切力（强力高速的震荡）、高温（破坏化学键，常规操作温度为0－4℃，可降低核酸酶的活性，减少核酸的生物降解）。 防止核酸的生物降解，核酸酶消化磷酸二酯键，破坏一级结构。其中DNA酶，需要二价金属离子的激活（Mg2＋），使用二价金属离子鳌合剂EDTA，基本上可抑制DNA酶的活性。 实验二 聚合酶链式反应及DNA的琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 1、掌握PCR反应的原理，学习PCR的方法，熟悉PCR扩增仪的使用。 2、了解PCR反应条件的优化及引物设计。 3、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。 二、实验原理 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是Karry Mullis于1985年创立的一种通过体外酶促扩增获取大量特异DNA片段的方法。 PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应，模拟天然DNA的复制机制。PCR的特异性取决于引物和模板的特异性结合。PCR的全过程是以变性、退火、延伸三步反应为一周期，通过若干轮的循环完成的，其中每一步的转换是通过改变反应温度来控制。 1、变性（denaturation） 模板DNA在95℃左右的高温条件下双链间的氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA并游离于反应液中。 2、退火（annealing） 热变性后将温度降低，人工合成的两个寡核苷酸引物分别与模板DNA扩增区