第四章 蛋白质的稳定性和稳定化要点.ppt

第四章 酶蛋白质的稳定性和稳定化 在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。 提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。 下面举一个如何通过蛋白质工程来提高重组β-干扰素专一活性和稳定性的例子。 干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的β-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？ 研究发现，β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然β-干扰素的贮存稳定性高很多。 提高酶蛋白质的稳定性? 葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10～12℃；酶比活相同。 据分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。 第一节 蛋白质的稳定性 蛋白质稳定性的分子原因 金属离子、底物、辅因子和其他低相对分子质量配体的结合作用 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 盐桥和氢键 二硫键 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 氨基酸残基的坚实装配 疏水相互作用 科学家发现能预测蛋白质稳定性的小分子 近日，德克萨斯州立大学医学院(UTMB)的研究人员发现了一种新的方法，可预测一种特殊小分子在处于极端环境的各种器官中所具备的能力。 研究结果发表在10月7日网络版的《美国国家科学院院刊》（PNAS）中，该方法是通过一种叫渗透剂的有机小分子对细胞内蛋白质稳定性影响情况来进行研究的。结果将有助于老年痴呆症、囊肿性纤维化、肾脏疾病和稳定蛋白药物等的研究。 渗透剂的作用第一次是在1982年被发现，其主要作用是保护在逆境中的生物。它们能保护人肾脏中的细胞，如分解掉大量含破坏蛋白质的化学尿素；它们能使一种冻结的北极青蛙在无损伤的情况下解冻；并且它们还能使奇异微小生物水熊生活在极度干燥、强烈辐射和绝对零度以上几度到过热蒸汽的温度范围内。 ?Matthew Auton和D. Wayne Bolen在文章中描述了热力学计算的应用，并成功预测了多种渗透剂在逆境状态下保护蛋白质的能力。极热、极冷或细胞周围化学环境的改变均能影响蛋白质正常功能的行使，而渗透剂则可以让蛋白质具有正确的结构形式，并正常行使功能。 蛋白质是折叠的，生物医学研究的主要目的就是了解它们折叠或在不稳定时展开的原因。 需要研究渗透剂是如何影响不同蛋白质的稳定性的，以及它们之间的互作情况，这将为研究蛋白质折叠过程提供重要的信息。 蛋白质的折叠与伸展是病变的一个明显特征，如老年痴呆症、疯牛病和囊肿性纤维化。渗透剂在人体多种器官行使功能，尤其是在肾脏和大脑中。没有渗透剂，肾脏将无法行使功能，大脑组织也不能反应。 医学研究主要针对它们在肾脏中的作用，而它们也出现在其它很多组织中，该项技术将有助于医学研究人员研究渗透剂在整个体内的作用。 第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理 蛋白水解酶和自溶作用 聚合作用 极端pH 氧化作用 表面活性剂和去污剂 变性剂 重金属离子和巯基试剂 热 机械力 冷冻和脱水 辐射作用 第三节 蛋白质的稳定化 固定化 酶修饰 蛋白质工程 工程二硫键 增加蛋白质内部疏水性 酶表面亲水化 抗氧化失活 Asn脱胺失活 酶的失活和再活化 第四节 各种酶稳定化方法的比较 一、酶稳定化的标准 稳定性至少增加1-3个数量级 应对各种酶失活因素（物理、化学及生物学因素）都有保护作用 稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性 稳定化方法应适合各类蛋白质 稳定化方法应在体内、体外都适用 从经济角度看，方法应具有放大的潜力 评定稳定化方法的标准 稳定性至少增加1~3个数量级 应对各种酶失活因素都有保护作用 稳定化不应减少酶活力