09第九讲蛋白质的化学修饰与克隆(二)辩析.ppt

蛋白质化学修饰——复习 蛋白质化学修饰的目的和意义？ 蛋白质化学修饰的主要部位是什么？ 什么是位点专一性修饰？ 亲和标记及其分类，与竞争性可逆作用的主要区别是什么？ 肽链中出现切开，蛋白质三维结构和生物活性还能保持吗？若变性和复性会发生什么现象，这一现象有何意义。 提高蛋白质药物体内稳定性的策略。化学修饰？如何修饰？举例说明 为什么要进行蛋白质改造？ 理论上，针对蛋白一级结构—高级结构—生物功能关系问题 应用上，针对蛋白质生物进化的适应性和生物活性的问题。 工业用酶：体外稳定性差，易失活。高温、高压、有机溶剂环境活性低、易失活 医用：抗原性、过敏反应、体内半衰期短等等 因此，需要对蛋白进行改造，在理论上和实践上具有重要意义。 为什么要利用分子生物学改造 化学合成，尤其是批量人工合成蛋白，造价高成本大，很难满足研究和生产需要。 生物体蛋白质合成的中心法则：基因→转录→翻译→蛋白质 20th 70S以来， PCR技术和DNA重组技术建立和发展，基因工程广泛应用，以及基因突变等基因改造技术的发展；（关键技术） 分子生物学技术，已经成为蛋白质改造的有力工具，并形成一整套的技术，具有其独特的优势。(基因的克隆、筛选、表达) 优势：通过改变遗传密码。在一级结构上，能够随心所欲地改造蛋白质。 在实践上已充分证实，并有许多成功的实例和借鉴，方法简便、易行。 DNA合成的造价远远低于蛋白质的合成，当代，基因的合成已不是问题。 蛋白质分子生物学改造的策略——经验 热稳定提高，有助于耐有机溶剂、极端pH 分子中引入适当的二硫键，显著提高稳定性 在高温下，蛋白质Gln、Asn 脱氨，影响生物功能，替换成其他合适的氨基酸。 原核生物表达真核基因，重组蛋白表达高，但活力低——替换重组多肽中多余的Cys，降低错误折叠的可能性，提高表达产物的生物活性。 提高酶催化活性 根据酶活性中心结构参数和催化反应机理，替换个别氨基酸残基，随机改造肽段，或删除末端氨基酸序列等。 消除酶被抑制特性序列，强化配体—受体的亲和性，改善酶的催化特性。 异源蛋白质药物，导致过敏——构建（人—鼠）嵌合基因，表达嵌合抗体，减少药物的抗原性。 蛋白质基因改造方法： 采用现代分子生物学技术——主要包括3种 基因突变、 基因融合、 掺入非天然氨基酸等。 以下简单介绍这 三种技术，本节要求掌握前2种技术 一、基因突变技术 1、什么是？ 在基因水平上对其编码蛋白质分子的基因进行改造， 通过其表达产物，来研究蛋白质结构和功能， 或得到优良蛋白质分子菌种的分子生物学技术。 2、技术先进性 可称为：蛋白质结构—功能关系研究的革命性变化； 随心所欲、方便地 研究特定氨基酸残基、特定结构单元，在蛋白质结构形成 和 功能表达 中的作用； 创造新型具有优良特性的蛋白质分子，满足应用的需要。 3、类型（2种） 定点突变和定向进化 3、基因突变的分类 3.1 定点突变（site directed mutagenesis） 如何理解？ 在基因水平上，将DNA序列（基因）中某一特定位点碱基进行改变的分子操作技术。 进一步理解 取代、插入或删除——已知DNA序列中——特定的核苷酸， 表达蛋白质结构中 个别 aa 残基变化的——分子操作技术。 理性分子设计 ？ 定点诱变技术用来对蛋白质（酶）分子重新设计并改造其物理化学性能， 同时可以进行酶分子的构象-功能相互关系的研究。 在已知蛋白结构和功能基础上，有目的、有计划地设计和改变蛋白分子中某一活性基团和模块，从而产生新性状分子。因此称理性分子设计。 特点： 与物理、化学等自然因素诱变方法相比 突变位点清楚、突变率高、简单易行、重复性好 定点突变小结： 定点突变 定点突变的基因的筛选方法 Kunkel突变法 基于抗生素抗性“回复” 突变的方法 基于去除特定限制酶切位点的突变方法 聚合酶链式反应（PCR）产生定点突变的方法 定点突变一般的方案设计 3.2 定向进化 （1）定向进化技术——在体外（试管中）模拟体内突变、重组和选择等自然进化过程，使蛋白质的进化朝着人们需要的方向发展的技术。 于20世纪90年代初，美国工程院院士，加州理工学院化工系教授，Frances??Arnold，在达尔文自然进化理论的启迪下提出的。 定向进化的实质——是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 自然进化和定向进化—两者的不同 （2）定向进化思路 从一个目标基因或一群相关的家族基因起始，通过体外引入突变和/或重组的方法，创建分子的多样性。 利用特定的选择或筛选的方法，从突变多样性基因文库中，筛选出功能产物的基因。 进入下一轮进化，重复这个过程直到达到预定的目标。 也就是说，定向进化的宗旨是“得到你想要的” 突变基因和突变体 （3）定向进化